楊江濤， 王旭靜， 哈斯阿古拉， 王志興

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081；2.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010021)

棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，不僅是重要的油料和纖維作物，也是紡織制造業(yè)的優(yōu)選原料，并且還是重要的戰(zhàn)略儲(chǔ)備物資。由于其具有較強(qiáng)的抗旱耐鹽能力，也是缺水地區(qū)和鹽堿地區(qū)的優(yōu)選種植作物之一[1]。隨著物質(zhì)生活和消費(fèi)水平的日益提高，人們對(duì)棉紡織品的質(zhì)量要求和需求也越來越高[2]，高新紡紗制造業(yè)對(duì)原棉的品質(zhì)也提出了更高的要求。因此，培育高品質(zhì)棉花纖維新品種已經(jīng)成為目前棉花育種工作的首要目標(biāo)之一。

由于棉花生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、種質(zhì)間相互利用困難、纖維產(chǎn)量與品質(zhì)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系等因素的制約，采用常規(guī)雜交育種方法很難在短期內(nèi)培育出纖維品質(zhì)優(yōu)良的棉花新品種。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用為棉花纖維品質(zhì)的改良提供了一條新的途徑[3]。它能夠克服物種間遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，將其他物種中具有優(yōu)良性狀的基因克隆到棉花基因組中，從而提高棉花各方面的抗性和纖維的品質(zhì)。研究人員經(jīng)過20多年的努力，克隆出了許多直接參與棉纖維合成和調(diào)控纖維伸長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因及其啟動(dòng)子，例如，海島棉纖維優(yōu)勢(shì)表達(dá)FbL2A基因及其啟動(dòng)子[4]、陸地棉編碼β-微管蛋白纖維優(yōu)勢(shì)表達(dá)GhTUB1基因及其啟動(dòng)子[5]、在棉纖維發(fā)育全過程中特異表達(dá)的FSltp4基因啟動(dòng)子[6]、纖維伸長(zhǎng)期優(yōu)勢(shì)表達(dá)GhCPK1基因及其啟動(dòng)子[7]、調(diào)控纖維發(fā)育的纖維特異表達(dá)GhPRP5基因及其啟動(dòng)子[8]、棉纖維特異表達(dá)的CFSP基因啟動(dòng)子[9]、陸地棉纖維優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因GhRACK1的啟動(dòng)子[3]、海島棉纖維特異表達(dá)GbEXPA2基因及其啟動(dòng)子[10]以及棉絨纖維發(fā)育相關(guān)的調(diào)控基因MIXTA[11]等。上述基因?yàn)榕嘤齼?yōu)良纖維品質(zhì)的棉花新種質(zhì)提供了扎實(shí)的理論基礎(chǔ)。

Uhrf1編碼具有RING結(jié)構(gòu)域的E3泛素蛋白連接酶，其參與調(diào)節(jié)植物分生組織中細(xì)胞的分裂分化和增殖過程。例如，擬南芥PUB4可以調(diào)節(jié)根部分生組織中細(xì)胞的不對(duì)稱分裂和細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)根的生長(zhǎng)發(fā)育[12]；水稻TUD1與異三聚體Ga亞基相互作用共同調(diào)節(jié)水稻中的油菜素類固醇(BR)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而介導(dǎo)水稻的生長(zhǎng)發(fā)育[13]；煙草PUB4是與CHRK1受體類激酶相互作用的配偶體，并且可能參與調(diào)節(jié)由CHRK1介導(dǎo)的植物絨毯層細(xì)胞分化生長(zhǎng)和降解途徑[14]。棉纖維是單個(gè)胚珠外珠被表皮細(xì)胞經(jīng)過特殊化的起始分化、伸長(zhǎng)、增厚和脫水，最終形成成熟表皮纖維[15]。棉花纖維原始細(xì)胞的分化起始是一個(gè)極其復(fù)雜的代謝過程，依賴多種物質(zhì)信號(hào)進(jìn)行多層次多途徑的精確網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，并且棉花胚珠外珠被表皮細(xì)胞突起的多少?zèng)Q定最終成熟纖維的數(shù)量，而分化起始的早晚決定纖維長(zhǎng)短絨的類型[16]。因此，推測(cè)Uhrf1在棉纖維原始細(xì)胞分化起始過程中發(fā)揮著重要作用。

開發(fā)纖維特異啟動(dòng)子或種皮發(fā)育特異啟動(dòng)子是我國(guó)棉花優(yōu)質(zhì)纖維新品種研究的主要目標(biāo)之一。本研究通過對(duì)棉花根葉混合和纖維兩個(gè)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)Ghuhrf1基因?qū)儆诶w維細(xì)胞分化起始期優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因?；陉懙孛轙M-1基因組數(shù)據(jù)庫(kù)信息，克隆了Ghuhrf1基因的5’上游啟動(dòng)子Ghuhrf1-Pro序列，構(gòu)建不同長(zhǎng)度缺失體分析了啟動(dòng)子序列中的重要順式作用元件，以期為Ghuhrf1基因的功能研究奠定基礎(chǔ)，并為棉花纖維品質(zhì)改良基因工程提供新的基因資源和調(diào)控元件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1供試材料 陸地棉(Gossypiumhirsutum)蘇棉12、本氏煙草(Nicotianabenthamiana)和野生型擬南芥(Col0)種子由本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；pMD18-T載體購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，農(nóng)桿菌LBA4404、植物表達(dá)載體pCambia 1305.1由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑 常規(guī)質(zhì)粒提取和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購(gòu)于NEB公司；高保真DNA聚合酶購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司；RACE試劑盒(The GeneRacerTMRNA Oligo)購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；其他生化試劑均為分析純，購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司?；驕y(cè)序和引物合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1Ghuhrf1基因全長(zhǎng)cDNA的克隆 參考The GeneRacerTMRNA Oligo試劑盒說明書，首先對(duì)纖維mRNA進(jìn)行脫磷、脫帽處理，然后再以O(shè)ligo dT為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最后以GeneRacer 5’Primer/Ghuhrf1-5’GSP1和GeneRacer 5’Nested Primer/Ghuhrf1-5’GSP2為引物(表1)，通過兩次PCR從棉纖維cDNA中擴(kuò)增得到Ghuhrf1的5’末端產(chǎn)物。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。同理，以GeneRacer 3’Primer/Ghuhrf1-3’GSP1和GeneRacer 3’Nested Primer/Ghuhrf1-3’GSP2為引物(表1)，進(jìn)行兩輪PCR得到3’末端產(chǎn)物，PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。將得到的產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，組裝后獲得Ghuhrf1的全長(zhǎng)cDNA。

表1 本研究所用的引物

1.2.2Ghuhrf1基因熒光定量PCR 提取蘇棉12的根、葉片、花藥、柱頭和0、5、7、14、21、26 和28 DPA(days post anthesis)纖維的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以q-sad-F/q-sad-R為內(nèi)參基因引物，以q-Ghuhrf1-F/q-Ghuhrf1-R為目標(biāo)基因引物，進(jìn)行熒光定量PCR分析，具體操作步驟參照ABI7500熒光定量PCR操作手冊(cè)。

1.2.3Ghuhrf1基因啟動(dòng)子的克隆 將Ghuhrf1基因序列與中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所CGP(cotton genome project)數(shù)據(jù)庫(kù)中陸地棉TM-1基因組進(jìn)行同源比對(duì)。參照其基因組信息，設(shè)計(jì)引物(Ghuhrf1P-F和Ghuhrf1P-R)(表1)，以14 DPA纖維的基因組DNA為模板，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增Ghuhrf1基因5’上游序列。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將擴(kuò)增的目的條帶與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4Ghuhrf1-Pro缺失體的克隆與植物表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)Ghuhrf1-Pro序列設(shè)計(jì)引物(表1)，在下游和上游引物的5’端分別添加了NcoⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)。以Ghuhrf1-Pro質(zhì)粒為模板，分別以R/F-1417、R/F-1180、R/F-867、R/F-726和R/F-328為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(30 μL)：2×Phanata Max Buffer 15 μL，dNTP Mix 1 μL，上、下游引物各0.8 μL，Phanata Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，模板 1 μL，ddH2O 10.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃或52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。獲得的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選陽(yáng)性克隆并測(cè)序鑒定。選擇pCamBIA1305.1質(zhì)粒作為植物表達(dá)載體骨架，雙酶切構(gòu)建植物表達(dá)載體，并分別命名為pGhuhrf1-Pro、pGhuhrf1-Pro1、pGhuhrf1-Pro2、pGhuhrf1-Pro3和pGhuhrf1-Pro4。

1.2.5農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化本式煙和擬南芥 利用熱擊法[17]將植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，培養(yǎng)在YEB液體培養(yǎng)基(250 mg·L-1鏈霉素、250 mg·L-1利福平和50 mg·L-1卡那霉素)中。收集菌體并用液體MS基本培養(yǎng)基重懸稀釋至OD600為0.4左右。首先，侵染本氏煙草葉片進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)[18]：在本氏煙植株6～8片真葉期，選取距離頂部最近的嫩葉，用1 mL的微量針管進(jìn)行葉下表皮注射，最少注射整個(gè)葉片的2/3，高濕度黑暗條件下培養(yǎng)16 h，然后正常培養(yǎng)(16 h光照/8 h黑暗)2 d，將葉片取下進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。其次，利用花絮浸染法將植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)實(shí)驗(yàn)[19]：挑選花期正旺的擬南芥植株，剪掉授完粉和長(zhǎng)出角果的部分，將花序浸沒在含有0.03% silwet L-77的重懸菌液中，靜置5 min后置于23 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)24 h后正常培養(yǎng)(16 h光照/8 h黑暗)。將獲得的T0代種子在含有 50 mg·L-1潮霉素的MS固體培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體。

1.2.6轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR檢測(cè) 提取轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組DNA，利用對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.7GUS組織化學(xué)染色 參考Jefferson等[20]的方法，將待染色葉片浸入X-gluc溶液中，用parafilm封口膜封口，37 ℃避光放置12 h，鏡檢前，用FAA固定液浸泡15 min，之后依次用75%乙醇溶液、85%乙醇溶液、95%乙醇溶液和100%乙醇脫色，去除色素，然后進(jìn)行顯微鏡觀察，白色背景下的藍(lán)色即為GUS表達(dá)位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ghuhrf1基因全長(zhǎng)cDNA的分析

通過分析棉花根葉混合和纖維兩個(gè)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，獲得開花當(dāng)天差異表達(dá)的EST序列并設(shè)計(jì)引物，通過5’RACE和3’RACE方法分別擴(kuò)增出503 bp和586 bp的條帶。與EST序列進(jìn)行拼接后，獲得基因全長(zhǎng)cDNA為2 278 bp，其中5’UTR長(zhǎng)226 bp，3’UTR為201 bp，CDS長(zhǎng)度為 1 851 bp，編碼616個(gè)氨基酸，分子量為68.3kD，等電點(diǎn)為6.60。Blastn比對(duì)結(jié)果表明，獲得的Ghuhrf1基因與已知的uhrf1基因同源性較高，與亞洲棉和可可中的uhrf1基因的核苷酸序列相似性分別為99%和88%。通過NCBI在線網(wǎng)站中的CDD對(duì)推測(cè)蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)位于16～61、133～171和461～523 aa之間存在RING結(jié)構(gòu)域，編碼產(chǎn)物為E3 泛素連接酶，其主要是充當(dāng)“橋接因子”，將復(fù)合體蛋白-E2與泛素底物連接來促進(jìn)泛素轉(zhuǎn)移，從而影響植物體中蛋白質(zhì)的豐度和蛋白質(zhì)的活性。

蛋白同源性分析結(jié)果表明，推導(dǎo)的蛋白與E3泛素蛋白連接酶蛋白家族中的UHRF1蛋白具有很高的相似性，與亞洲棉中的UHRF1蛋白同源性最高，親緣關(guān)系最近，相似性可達(dá)98%；其次為可可和榴蓮，相似性為87%；與其他已知的UHRF1蛋白的相似性也都在70%以上，如與黃麻、柚子、木薯和蓖麻(圖1)。由此推測(cè)克隆到的基因?yàn)镋3泛素蛋白連接酶UHRF1家族，將其命名為Ghuhrf1.

圖1 GhUHRF1蛋白的同源進(jìn)化樹

2.2 Ghuhrf1的組織表達(dá)特異性分析

從圖2可以看出，Ghuhrf1基因在開花當(dāng)天的胚珠中表達(dá)量最高，是根、葉和柱頭表達(dá)量的4倍左右，而在纖維其他發(fā)育時(shí)期中只有微量的表達(dá)。因此，推測(cè)Ghuhrf1基因直接參與棉纖維的合成或間接的調(diào)控棉纖維原始細(xì)胞的分化起始。

注：*和**分別表示差異與根中相比在P<0.05和P<0.01水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 Ghuhrf1啟動(dòng)子的克隆及序列分析

將Ghuhrf1基因序列與CGP數(shù)據(jù)庫(kù)中的陸地棉TM-1基因組進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)Ghuhrf1基因序列位于D基因組的第6染色體上。基于陸地棉基因組信息，從蘇棉12基因組DNA中擴(kuò)增得到Ghuhrf1基因5’上游序列。經(jīng)過測(cè)序，去除與基因重疊和5’UTR的序列，共獲得1 417 bp的5’上游序列。

利用PlantCARE和PLACE軟件在線分析Ghuhrf1啟動(dòng)子序列中的順式作用元件。發(fā)現(xiàn)該序列中除了含有GC-box、CAAT-box、Inr等啟動(dòng)子基本核心元件外，還含有與分生組織表達(dá)相關(guān)的CAT-box元件和CCGTCC-box元件、與種子特異表達(dá)有關(guān)的ACGT-motif元件和AACA-motif元件、與花器官特異表達(dá)的Skn-1 motif元件、與胚乳特異基因的表達(dá)有關(guān)AACACOREOSGLUB1元件、與葉特異表達(dá)相關(guān)的INRNTPSADB元件和AT-1 box元件等(表2)。

表2 Ghuhrf1啟動(dòng)子序列中順式元件分析

2.4 Ghuhrf1啟動(dòng)子缺失體分析

根據(jù)Ghuhrf1啟動(dòng)子序列上順式作用元件的位置分布情況，對(duì)Ghuhrf1啟動(dòng)子進(jìn)行了不同長(zhǎng)度的缺失，利用PCR方法克隆得到了Pro1(-1 180～+226 bp)、Pro2(-867～+226 bp)、Pro3(-726～+226 bp)和Pro4(-328～+226 bp)四個(gè)缺失體。相對(duì)于Ghuhrf1全長(zhǎng)啟動(dòng)子Pro(-1 417～+226 bp)來說，Pro1缺失了與種子特異表達(dá)有關(guān)的ACGT-motif元件；Pro2缺失了與種子特異表達(dá)有關(guān)的AACA-motif元件和與葉的特定表達(dá)相關(guān)的AT-1 box元件；Pro3缺失了與分生組織表達(dá)相關(guān)的CAT-box和CCGTCC-box元件；Pro4缺失了所有的與分生組織表達(dá)和器官組織特異表達(dá)相關(guān)的調(diào)控元件，只含有GC-box、CAAT-box和Inr等啟動(dòng)子核心調(diào)控元件(圖3)。

圖3 Ghuhrf1-Pro缺失體結(jié)構(gòu)

以pCAMBIA1305.1為載體骨架，以Gus基因?yàn)閳?bào)告基因，分別構(gòu)建了全長(zhǎng)啟動(dòng)子Ghuhrf1-Pro和4個(gè)啟動(dòng)子缺失體的植物表達(dá)載體用于驅(qū)動(dòng)活性分析。

2.5 煙草瞬時(shí)結(jié)果表達(dá)分析

將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化本氏煙草，3 d后進(jìn)行組織化學(xué)染色(圖4)。轉(zhuǎn)經(jīng)過組織化學(xué)染色和脫色后，空載體農(nóng)桿菌的葉片呈現(xiàn)無色，說明沒有背景污染；注射含有35S啟動(dòng)子的pCamBIA1305.1農(nóng)桿菌的葉片呈現(xiàn)藍(lán)色，說明Gus基因可以進(jìn)行正確表達(dá)；轉(zhuǎn)Ghuhrf1-Pro和4個(gè)缺失體的葉片經(jīng)過組織化學(xué)染色和脫色后，呈現(xiàn)藍(lán)色，說明Ghuhrf1-Pro和4個(gè)缺失序列都能夠啟動(dòng)Gus基因的表達(dá)。因此，可以進(jìn)一步用于分析該啟動(dòng)子中順式作用元件的主要功能。

圖4 不同Ghuhrf1缺失體驅(qū)動(dòng)Gus基因在煙草葉片中的瞬時(shí)表達(dá)

2.6 不同缺失體驅(qū)動(dòng)活性分析

分別取不同缺失體轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行GUS組織化學(xué)分析(圖5)。染色結(jié)果表明，含有全長(zhǎng)啟動(dòng)子Pro的轉(zhuǎn)基因擬南芥只能在生長(zhǎng)分化比較旺盛的部位檢測(cè)到GUS蛋白活性，例如葉邊緣尖部、蓮座葉基部和未成熟角果頂端。缺失體Pro1的轉(zhuǎn)基因擬南芥，Gus基因在葉邊緣尖部和蓮座葉基部中的表達(dá)模式與全長(zhǎng)啟動(dòng)子基本一致，但是在未成熟角果頂端部位表達(dá)量有所降低，說明ACGT-motif元件能增強(qiáng)啟動(dòng)子在種子器官中的活性。缺失體Pro2的轉(zhuǎn)基因擬南芥葉邊緣尖部和蓮座葉基部中，Gus基因的表達(dá)水平與全長(zhǎng)啟動(dòng)子相比有所降低，而在未成熟角果頂端部位沒有檢測(cè)到Gus基因的表達(dá)，說明ACGT-motif和AACA-motif元件的缺失導(dǎo)致Gus基因不能在種子中表達(dá)，因此，充分證明了這兩個(gè)元件為種子特異表達(dá)相關(guān)元件。缺失體Pro3的轉(zhuǎn)基因擬南芥葉邊緣尖部和蓮座葉基部中，Gus基因的表達(dá)水平與全長(zhǎng)啟動(dòng)子相比明顯降低，并且在未成熟角果頂端部位也沒有檢測(cè)到GUS蛋白活性，說明CCGTCC-box元件能增強(qiáng)啟動(dòng)子在分裂分化旺盛部位中的活性。然而，在只含有啟動(dòng)子基本作用元件的缺失體Pro4轉(zhuǎn)基因擬南芥中，Gus基因的表達(dá)呈現(xiàn)組成型表達(dá)，在整株植物體各個(gè)組織中都有表達(dá)，但是GUS蛋白的表達(dá)量均沒有CaMV 35S啟動(dòng)子的高，表明CAT-box元件和CCGTCC-box元件為分生組織特異表達(dá)元件。上述分析進(jìn)一步證明ACGT-motif和AACA-motif元件為種子特異表達(dá)相關(guān)元件，CAT-box元件和CCGTCC-box元件為分生組織表達(dá)相關(guān)元件。由于棉花纖維是由單個(gè)胚珠外珠被表皮細(xì)胞經(jīng)過特殊化的分化起始、伸長(zhǎng)、增厚和脫水成熟過程而最終形成種子表皮纖維，因此，推測(cè)全長(zhǎng)啟動(dòng)子上的這些元件與種子發(fā)育和細(xì)胞生長(zhǎng)分化時(shí)期密切相關(guān)，可能是其在棉花纖維細(xì)胞原始細(xì)胞分化起始過程中所必需的。

圖5 不同Ghuhrf1缺失體驅(qū)動(dòng)Gus基因在擬南芥中的穩(wěn)定表達(dá)

3 討論

棉花纖維是由單個(gè)胚珠表皮細(xì)胞經(jīng)過多次分化和發(fā)育等一系列復(fù)雜的過程而形成的種子纖維，根據(jù)棉纖維發(fā)育過程中表現(xiàn)的各種不同特征，研究人員將其劃分為4個(gè)發(fā)育階段：原始纖維細(xì)胞的分化起始階段、纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)階段、次生壁加厚階段和脫水成熟階段。在棉纖維原始細(xì)胞分化起始期，胚珠表皮上接近30%的纖維原始細(xì)胞進(jìn)行分化形成纖維細(xì)胞，最終形成成熟的纖維[21]。因此，該時(shí)期直接決定了棉花成熟纖維的數(shù)量。本研究利用差異基因表達(dá)譜分析技術(shù)篩選到一條纖維原始細(xì)胞分化起始期優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因Ghuhrf1，該基因在開花當(dāng)天(0 DPA)的胚珠中表達(dá)量最高，在纖維其他時(shí)期中只有微量的表達(dá)，然而開花當(dāng)天正是棉纖維原始細(xì)胞分化開始階段，復(fù)雜的調(diào)控途徑調(diào)控著纖維原始細(xì)胞分化的起始。許多研究報(bào)道具有E3泛素蛋白連接酶基因uhrf1參與調(diào)節(jié)分生組織中細(xì)胞的分裂分化和細(xì)胞增殖過程[22-23]。因此，推測(cè)Ghuhrf1基因主要參與棉纖維的合成或者參與對(duì)棉纖維原始細(xì)胞分化起始的調(diào)控。

纖維特異啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)外源優(yōu)良基因只在纖維中進(jìn)行表達(dá)，相比于組成型啟動(dòng)子，它能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因的定時(shí)定點(diǎn)表達(dá)，同時(shí)還能夠避免棉花體內(nèi)代謝產(chǎn)物的浪費(fèi)。組織特異性啟動(dòng)子除了具有核心啟動(dòng)子所必需的順式作用元件(CAAT-box，TATA-box等)外，還存在一些調(diào)控基因在組織中特異表達(dá)的作用元件，如CAT-box元件和CCGTCC-box元件為分生組織特異表達(dá)的調(diào)控元件[24]，RHEs為根毛特異表達(dá)的調(diào)控元件[25-26]，AACA-motif、AT-1 box、ACGT和GATA等順式作用元件為決定組織特異表達(dá)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)[27]等。根據(jù)重要調(diào)控元件在啟動(dòng)子序列上的位置分布情況，有目的性的從啟動(dòng)子5’端上游序列對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行不同程度的缺失，通過轉(zhuǎn)基因植物中報(bào)告基因的表達(dá)情況可推斷調(diào)控元件的主要功能[28-29]。本研究參考陸地棉TM-1基因組信息，克隆了Ghuhrf1基因5’上游序列，該啟動(dòng)子除了含有GC-box、CAAT-box和Inr等核心啟動(dòng)子所必需的順式作用元件外，還含有一些與器官組織特異表達(dá)相關(guān)的調(diào)控元件，例如，CAT-box元件、CCGTCC-box元件、AT-1 box元件、AACA-motif元件、ACGT-motif元件等。通過比較不同缺失體中Gus基因的表達(dá)情況，證明CAT-box元件和CCGTCC-box元件是分生組織表達(dá)所必需的調(diào)控元件，并且這些調(diào)控元件的數(shù)量決定著啟動(dòng)子活性的強(qiáng)弱。研究表明,棉纖維的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制與煙草和擬南芥的根毛及表皮毛的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制具有相似性[30-33]。然而，在全長(zhǎng)啟動(dòng)子Ghuhrf1-Pro和4個(gè)缺失體Pro1、Pro2、Pro3的轉(zhuǎn)基因擬南芥的根毛及表皮毛中都沒有檢測(cè)到Gus基因的表達(dá)。因此，推測(cè)Ghuhrf1基因可能不直接參與棉纖維的合成，而是間接的參與棉纖維原始細(xì)胞分化起始的調(diào)控。但是，Ghuhrf1基因參與哪些代謝調(diào)控和調(diào)控哪些基因等一系列重要問題，這些問題的解決方案仍有待進(jìn)一步證實(shí)。