鮮義坤，楊 楠，孔 凌，李裕冬，劉張育，陳緒玲，鄧 虹，熊鐵一*

（1.四川省自然資源科學(xué)研究院，成都 610041；2.成都大帝漢克生物科技有限公司，成都 611130）

在人工飼養(yǎng)條件下每天都要喂給亞成年和成年大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）一定數(shù)量的水果類食物——蘋果和蔬菜類食物——胡蘿卜[1-2]，以補充維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，保障大熊貓身體健康和快樂生活。野生大熊貓對竹子具有明顯的選擇性采食[3-4]，圈養(yǎng)大熊貓對不同種類的水果也呈現(xiàn)不同的采食選擇傾向，對有些水果供試大熊貓都不采食，對有些水果有的個體采食而有的個體不采食[5]，但對蘋果卻普遍表現(xiàn)出非常喜歡采食，此外對胡蘿卜也喜歡采食。除采食習(xí)慣外圈養(yǎng)大熊貓為什么喜食蘋果和胡蘿卜？這2種果蔬類食物對圈養(yǎng)大熊貓來說是否存在氣味方面的誘食機制？本文試圖揭開圈養(yǎng)大熊貓優(yōu)先選擇蘋果和胡蘿卜采食的氣味之秘。

國內(nèi)外對蘋果氣味物質(zhì)的研究已有半個多世紀之久，通過多種不同的分析方法，共鑒定出300余種揮發(fā)性有機物（VOCs），不同的分析方法、品種、產(chǎn)地、栽培管理水平、采收時期、貯藏條件和時間等均有不同的成分測定結(jié)果，但與特征性香氣有關(guān)的物質(zhì)只有20～40 種[6-7]，這方面的文獻較多[6-15]；而對胡蘿卜氣味物質(zhì)研究的報道較少[16-22]；均從人的喜食風(fēng)味偏好和市場購買意愿角度去研究以便加工改善或育種改良，但未從大熊貓喜食氣味機理角度來分析這2種果蔬類食物的氣味及其成分。鹽源縣隸屬四川省涼山彝族自治州，地處青藏高原東南緣，享有亞熱帶季風(fēng)氣候，日照時間較長，所產(chǎn)蘋果個小味甜，未檢索出鹽源蘋果氣味成分的專門研究報道。頂空（HS）—固相微萃?。⊿PME）—氣相色譜（GC）—質(zhì)譜（MS）聯(lián)用分析技術(shù)可直接檢測樣品散發(fā)出的揮發(fā)性有機物，能真實、準確地反映樣品的氣味物質(zhì)種類及其濃度，成為當今世界測定樣品中未知氣味成分的主流方法。本文通過專業(yè)人員的嗅感品評和HS-SPME-GC-MS 聯(lián)用法研究蘋果和胡蘿卜的氣味特點與香氣成分，旨在探尋大熊貓喜歡的食物氣味及其物質(zhì)，進而探討大熊貓喜歡選擇這2種果蔬類食物采食的氣味機理。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

供試大熊貓2 只，1 只為春俏（雌性），譜系號968，生于2015年8月8日，采樣時年齡3歲；另1只為冰晶（雌性），譜系號943，生于2014年9月29日，采樣時年齡4 歲；均屬亞成體[1-2]，飼養(yǎng)于四川省峨眉山市仙芝竹尖生態(tài)園熊貓館，健康狀況良好，自由采食、飲水，圈內(nèi)隨意活動。按照規(guī)定的人工飼養(yǎng)規(guī)程進行日常飼喂和管理，每天喂給大熊貓600～800 g蘋果和胡蘿卜。

1.2 供試材料

①蘋果：產(chǎn)于四川省鹽源縣，人工栽培，屬富士品種，外觀顏色幾乎為暗紅色，即富士紅蘋果（以下簡稱蘋果），新鮮，果形較好，單果重為150～200 g。②胡蘿卜：產(chǎn)地不詳，人工種植，外觀顏色為橙黃色，即橙色胡蘿卜（以下簡稱胡蘿卜），新鮮，外形好，單個重為300～400 g。蘋果和胡蘿卜均購自四川省峨眉山市城區(qū)農(nóng)貿(mào)市場。

1.3 樣品采集與制備方法

通過大熊貓的飼喂試驗現(xiàn)場隨機取樣。蘋果和胡蘿卜先用流水清洗，去泥等異物，均未去皮，蘋果也未去果核，可體現(xiàn)大熊貓聞嗅蘋果和胡蘿卜的真實氣味。蘋果、胡蘿卜各任取1 個（根），一分為四，隨機取出3塊喂給大熊貓，當這3 塊果蔬都分別被大熊貓全部吃完后另外1 塊才用作樣品，即所采樣品可代表大熊貓所食的果蔬。如此獲得的一些果蔬樣品先切成細條狀，再切成顆粒狀，混合，隨機取出用于VOCs 分析或氣味品評的樣品，制好的樣品密封保存于-20 ℃的冰箱中待測評。采集的大樣和備好的小樣分別在裝有冰袋的保溫箱和保溫桶中運輸。在樣品采集和制備之前所有與樣品接觸的用具用品須經(jīng)反復(fù)清洗，達到干凈無味，以防其他氣味串入樣品。

1.4 氣味品評方法

供評樣品稱重2.0 g，與大熊貓所食其他食物一起編號，由6名專業(yè)品評人員在不知曉食物名稱的情況下盲評。具體方法參見文獻[23]。

1.5 HS-SPME-GC-MS方法

1.5.1 儀器設(shè)備

Agilent 7890B-5977B 型GC-MS 聯(lián)用儀；HPINNOWax 型超高惰性石英毛細管色譜柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；20 mL頂空瓶及其相應(yīng)的密封墊和鋁蓋；均由美國Agilent 公司出品。75 μm CAR/PDMS型SPME纖維頭和SPME手動進樣手柄均由美國Supelco 公司出品。其他器材和用品均為測試分析室常規(guī)配置。

1.5.2 HS-SPME方法

在70 ℃的條件下頂空萃取1 h。具體方法參見文獻[23]。

1.5.3 GC-MS方法

GC 條件：進樣口溫度為250 ℃，載氣為高純氦氣，柱流量為0.80 mL · min-1，進樣模式為分流，分流比為5∶1。程序升溫模式：起始溫度45℃，保持3 min，以5 ℃·min-1速率升至180℃，再以8 ℃·min-1速率升至260·℃，保持10 min。MS 條件及其數(shù)據(jù)處理：同文獻[24]的測試方法二。

1.6 香氣成分的判定標準

經(jīng)HS-SPME-GC-MS 聯(lián)用法測定的大多數(shù)VOCs 均有不同類型和不同強度的氣味，但有些氣味物質(zhì)對動物機體可產(chǎn)生不利甚至有害的影響。本文的香氣成分僅限于我國、歐盟、美國、日本的法規(guī)允許在加工類食品中添加使用，且在市場上可流通交易的單體呈香物質(zhì)，并非所有的揮發(fā)性有機物或氣味成分。據(jù)此標準從已測定的VOCs 中選出食品級的香氣物質(zhì)，便于研制大熊貓專用誘食劑時參考與應(yīng)用。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣味的嗅感品評

2.1.1 蘋果氣味的嗅感品評

整體上香氣濃郁、寬厚、圓潤、新鮮、透發(fā)，擴散性較強，愉悅度較高。屬水果香型[25]中的紅蘋果氣味，清香飄溢，甜氣明顯，略帶酒香和木香韻調(diào)，有人聞出微弱的酸香氣息。

2.1.2 胡蘿卜氣味的嗅感品評

整體上香氣強度較弱，愉悅度尚可。屬新鮮、成熟的胡蘿卜氣味，甜香和清香相對突出，稍有木香和壤香韻調(diào)，有人聞出微弱的油脂氣息。

2.2 VOCs和香氣成分

2.2.1 蘋果的VOCs和香氣成分

圖1 圈養(yǎng)大熊貓所食蘋果的VOCs總離子流色譜

表1 圈養(yǎng)大熊貓所食蘋果的VOCs

續(xù)表

蘋果的VOCs：見圖1和表1。

從表1可知，蘋果中可確定（匹配度≥80%，下同）的VOCs 有72 種，各自歸屬于有機化合物的類別見表2。

由表2 可知，蘋果中的VOCs 有9 類化合物。無論成分數(shù)量還是相對含量，酯類、烯烴類及醇類均為排在前3 位的類別，這3 類VOCs 成分數(shù)累計達59 種，占VOCs 成分總數(shù)的81.94%，相對含量累計達92.35%，說明酯類、烯烴類及醇類是蘋果的3 大主要有機化合物類別，其中最主要的VOCs是酯類，與文獻[6-8,10-15]一致。

蘋果的香氣成分：詳見表1 中帶※號的成分。由表1和表2可知，蘋果中可確定的香氣成分有55種，占VOCs總數(shù)的76.39%，各自歸屬于有機化合物的類別見表2。由表2 可知，蘋果中的香氣成分有8類化合物。就成分數(shù)量而言，酯類、醇類及烯烴類是排在前3位的類別，累計達47種，占香氣成分總數(shù)的85.45%；而在相對含量方面，則酯類、烯烴類及醇類是排在前3 位的類別，累計達89.94%，可見這3類香氣成分是蘋果氣味的主要貢獻物質(zhì)種類，對蘋果多種氣味的形成可能起到主要或主導(dǎo)作用。相對含量排在前10 位的單一香氣成分由高到低依次為α-金合歡烯、乙酸己酯、2-甲基丁酸己酯、己酸己酯、乙酸順式-2-己烯酯、丁酸己酯、乙酸丁酯、1-己醇、己酸丁酯、辛酸丁酯，這10 種香氣成分歸類為酯8種（相對含量小計47.33%）、烯烴1 種（相對含量為26.51%）、醇1 種（相對含量為2.94%），相對含量累計達76.78%，對蘋果主要氣味及其強度可能起到重大作用。

表2 蘋果中VOCs和香氣成分的歸類與相對含量統(tǒng)計

2.2.2 胡蘿卜的VOCs和香氣成分

圖2 圈養(yǎng)大熊貓所食胡蘿卜的VOCs總離子流色譜

胡蘿卜的VOCs：見圖2 和表3。從表3 可知，胡蘿卜可確定（匹配度≥80%）的VOCs 有47 種，各自歸屬于有機化合物的類別見表4。

表3 圈養(yǎng)大熊貓所食胡蘿卜的VOCs

續(xù)表

表4 胡蘿卜中VOCs的分類與相對含量統(tǒng)計

由表4 可知，胡蘿卜中的VOCs 有9 類化合物。就成分數(shù)量而言，烯烴類、酯類及芳烴類和醇類（并列）是排在前3 位的類別，按3 類VOCs 數(shù)量累計，有38種，占VOCs成分總數(shù)的80.85%。若按相對含量排序，烯烴類、芳烴類及醇類是排在前3位的類別，累計達97.66%，說明烯烴類、芳烴類及醇類是胡蘿卜的3大主要有機化合物類別，其中最主要的VOCs是烯烴類，其次是芳烴類。

胡蘿卜的香氣成分：詳見表3 中帶※號的成分。由表3 和表4 可知，胡蘿卜中可確定的香氣成分有26 種，占VOCs 總數(shù)的55.32%，各自歸屬于有機化合物的類別見表2。由表2 可知，胡蘿卜中的香氣成分有6類化合物。就成分數(shù)量而言，烯烴類、酯類及芳烴類和酮類（并列）是排在前3位的類別,按3類VOCs數(shù)量累計，為22種，占香氣成分總數(shù)的84.62%；而在相對含量方面，則是烯烴類、芳烴類及醇類是排在前3 位的類別，累計達82.81%，可見烯烴類和芳烴類這2大類香氣成分是胡蘿卜氣味的主要貢獻物質(zhì)種類，對胡蘿卜多種氣味的形成可起到主要或主導(dǎo)作用。相對含量排在前10 位的單一香氣成分由高到低依次為β-石竹烯、對傘花烴、γ-松油烯、異松油烯、a-蒎烯、d-檸檬烯、β-月桂烯、乙醇、β-蒎烯、α-松油烯，這10 種香氣成分歸類為烯烴8 種（相對含量小計58.22%）、芳烴1 種（相對含量為20.25%）、醇1 種（相對含量為1.71%），相對含量累計達80.18%，對胡蘿卜主要氣味及其強度可能起到重大作用。

由上述可知，圈養(yǎng)大熊貓喜食果蔬類食物的氣味物質(zhì)類別較為寬泛，共有醇類、醛類、酮類、羧酸類、酯類、烯烴類、芳烴類、雜環(huán)類等8類，其中主要是酯類、烯烴類、醇類、芳烴類。

3 討論

3.1 圈養(yǎng)大熊貓所食蘋果和胡蘿卜氣味形成的物質(zhì)基礎(chǔ)

依據(jù)文獻[26-27]對具有FEMA編號的單體呈香物質(zhì)氣味特征記載，如：己酸乙酯的氣味特征為甜的、清香、水果、菠蘿、蘋果、脂肪、奶制品香氣。從表1 和表3 中可分別找到可能引起蘋果和胡蘿卜多種氣味的一些香氣成分。

蘋果的水果香氣味可能與乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丁酯、己醛、乙酸-2-甲基丁酯、戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁酸丁酯、己酸乙酯、乙酸己酯、丙酸己酯、異丁酸己酯、1-己醇、乙酸庚酯、丙酸反式-2-己烯酯、反式-2-己烯-1-醇、己酸丁酯、丁酸己酯、2-甲基丁酸己酯、辛酸乙酯、異丁酸順式-3-己烯酯、丁酸反式-2-己烯酯、2-甲基丁酸反式-2-己烯酯、己酸戊酯、己酸己酯、辛酸己酯（以表1 中出現(xiàn)的先后為序，下同）等26種香氣成分有關(guān)。清香氣味可能與2-甲基丁酸乙酯、己醛、2-甲基-1-丁醇、反式-2-己烯醛、己酸乙酯、乙酸己酯、乙酸葉醇酯、異丁酸己酯、1-己醇、乙酸庚酯、反式-2-己烯-1-醇、己酸丁酯、丁酸己酯、2-甲基丁酸己酯、1-庚醇、己酸戊酯、1-辛醇、己酸己酯、順式-β-金合歡烯、α-金合歡烯、順式、反式-α-金合歡烯、辛酸己酯等22 種香氣成分有關(guān)。甜香氣味可能與乙酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸-2-甲基丁酯、戊酸乙酯、2-甲基丁酸丁酯、己酸乙酯、乙酸己酯、異丁酸己酯、1-己醇、辛酸乙酯、己酸戊酯、1-辛醇、己酸己酯、水楊酸甲酯等15 種香氣成分有關(guān)。酒香氣味可能與乙酸乙酯、乙醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、1-己醇、辛酸乙酯、1-庚醇、己酸戊酯等8種香氣成分有關(guān)。木香氣味可能與己醛、乙酸庚酯、2-甲基丁酸己酯、β-石竹烯、順式-β-金合歡烯、α-金合歡烯、順式，反式-α-金合歡烯等7 種香氣成分有關(guān)。酸香可能與丙酸己酯等香氣成分有關(guān)。蘋果的獨特氣味可能與戊酸乙酯、反式-2-己烯醛、己酸乙酯、乙酸己酯、乙酸葉醇酯、異丁酸己酯、己酸丁酯、辛酸己酯等8種香氣成分有關(guān)。

胡蘿卜的水果香氣味可能與β-月桂烯、γ-松油烯、β-羅勒烯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、丁酸己酯、己酸己酯、2-甲基丁酸、β-紅沒藥烯、順式-α-紅沒藥烯、反式-γ-紅沒藥烯、α-紅沒藥烯、香葉基丙酮、異戊酸芳樟酯（以表2 中出現(xiàn)的先后為序，下同）等13種香氣成分有關(guān)。清香氣味可能與β-月桂烯、β-羅勒烯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、丁酸己酯、己酸己酯、β-紅沒藥烯、順式-α-紅沒藥烯、反式-γ-紅沒藥烯、α-紅沒藥烯、香葉基丙酮等10 種香氣成分有關(guān)。甜香氣味可能與d-檸檬烯、β-羅勒烯、己酸己酯、水楊酸甲酯等4種香氣成分有關(guān)。木香氣味可能與a-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯、β-羅勒烯、異松油烯、乙酸冰片酯、β-石竹烯、β-紅沒藥烯、順式-α-紅沒藥烯、反式-γ-紅沒藥烯、α-紅沒藥烯、香葉基丙酮、氧化石竹烯等14 種香氣成分有關(guān)。壤香可能與莰烯等香氣成分有關(guān)。油脂氣息可能與6-甲基-5-庚烯-2-酮等香氣成分有關(guān)。胡蘿卜特殊的氣味可能與相對含量排名第二的對傘花烴等香氣成分有關(guān)。

總之，蘋果和胡蘿卜的某種氣味并非由一種香氣成分引起，而是由多種香氣成分相互作用（協(xié)同增效或抵消減弱）后的結(jié)果[28]。

3.2 圈養(yǎng)大熊貓喜歡的食物氣味

通過對圈養(yǎng)大熊貓采食行為的仔細觀察，圈養(yǎng)大熊貓喜食蘋果和胡蘿卜。結(jié)合上述氣味成分剖析，作者認為圈養(yǎng)大熊貓喜歡食物的綜合性氣味有水果香氣味、蘋果氣味、胡蘿卜氣味等，就單一香型氣味而言有清香氣味、甜香氣味等，這些氣味是誘導(dǎo)圈養(yǎng)大熊貓采食蘋果和胡蘿卜的主要氣味，可能因為圈養(yǎng)大熊貓熟悉這些氣味并認知它們是安全的，為自然選擇和長期進化所致。在食物供給充足的人工飼養(yǎng)條件下，食物的氣味是決定圈養(yǎng)大熊貓優(yōu)先選擇采食的首要食物因素，當然圈養(yǎng)大熊貓喜食蘋果和胡蘿卜還可能與采食習(xí)慣、蘋果和胡蘿卜的適口性（包括味道和質(zhì)構(gòu)等）以及營養(yǎng)性等有關(guān)，有待進一步研究。

4 結(jié)論

通過專業(yè)人員的嗅感品評，圈養(yǎng)大熊貓所食蘋果的香氣濃郁，擴散性較強，愉悅度較高，氣味屬水果香型中的紅蘋果氣味，清香飄溢，甜氣明顯，略帶酒香和木香；圈養(yǎng)大熊貓所食胡蘿卜的香氣強度較弱，愉悅度尚可，氣味屬新鮮、成熟的橙色胡蘿卜氣味，甜香和清香相對突出，稍有木香和壤香。經(jīng)HS-SPME-GC-MS 聯(lián)用法測定，從蘋果中共測出55 種香氣成分，可歸類為醇8 種、醛3 種、酮1 種、羧酸2 種、酯35 種、烯烴4 種、芳烴1種、雜環(huán)化合物1種，相對含量較高的香氣成分為α-金合歡烯、乙酸己酯、2-甲基丁酸己酯、己酸己酯、乙酸順式-2-己烯酯、丁酸己酯、乙酸丁酯、1-己醇、己酸丁酯、辛酸丁酯，可見酯類、烯烴類及醇類是蘋果氣味的主要貢獻物質(zhì)種類；從胡蘿卜中共測出26種香氣成分，可歸類為醇1種、酮2 種、羧酸1 種、酯6 種、烯烴14 種、芳烴2種，相對含量較高的香氣成分為β-石竹烯、對傘花烴、γ-松油烯、異松油烯、α-蒎烯、d-檸檬烯、β-月桂烯、乙醇、β-蒎烯、α-松油烯，可見烯烴類和芳烴類是胡蘿卜氣味的主要貢獻物質(zhì)種類。

致謝：西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院的包清彬教授、成都大帝漢克生物科技有限公司的李松柏高級工程師、黃明亞工程師、趙仁仟同志參加了香氣品評以及喻麟董事長和李小兵總經(jīng)理給予了支持,四川省峨眉山市仙芝竹尖生態(tài)園熊貓館原館長吳永中等同事在飼喂試驗和采樣時積極配合，中國科學(xué)院成都分院分析測試中心的胡靜副研究員在揮發(fā)性成分分析與推定方面提供了幫助，在此一并深表謝意！