蓋葉頂，王后福，王淑玲，矣 國，李鵬飛，楊仁輝，周榮康，楊 振，成 瀟，冷 靜

（云南農業(yè)大學云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，云南農業(yè)大學動物科學技術學院，云南昆明 650201）

反芻動物瘤胃是由細菌、真菌、古菌、原蟲、病毒等多種微生物共同參與、具有發(fā)酵功能的復雜器官，可將纖維物質轉化成反芻動物日?；顒铀枘芰浚谡{節(jié)宿主生理功能、代謝反應和抵御病原體等方面發(fā)揮著重要作用。相比傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)研究方法，宏組學研究通常旨在確定一組微生物、基因、變異體、途徑或代謝功能，以描述未培養(yǎng)樣本中的微生物群落[1]，因此利用宏組學策略能在系統(tǒng)層面解釋微生物-宿主之間的相互作用及代謝途徑，以更好分析瘤胃微生物在飼料利用率、功能基因篩選、減少畜牧業(yè)污染中的作用。本文介紹了近年來宏組學方法在反芻動物瘤胃微生物上的應用，為宏組學在瘤胃微生物研究上的運用提供參考和依據。

1 宏組學

宏組學是指微生物群落不依賴于培養(yǎng)的分析方法，包括宏基因組學、宏轉錄組學、宏蛋白質組學、宏代謝組學技術等組學研究[2]。宏基因組學通過提取特定環(huán)境（胃腸道、土壤、海洋、污水等）微生物總DNA，進行分析得出環(huán)境中微生物多樣性及分子生物學信息。宏轉錄組學從微生物總RNA水平上研究復雜微生物活動狀態(tài)，反映所形成蛋白質的種類、數量、修飾以及發(fā)揮功能的位置或區(qū)域等，其發(fā)揮功能作用還需要用宏蛋白質組學進行驗證。（宏）蛋白質組學方法可以分析剪接變體和共翻譯和翻譯后修飾，以及蛋白質-蛋白質相互作用和蛋白質復合物的檢測[3]。宏代謝組學通過確定代謝產物被釋放到環(huán)境中來完成功能網絡圖譜。宏組學數據結合起來分析能進一步揭示特定環(huán)境微生物功能、代謝活動之間的聯系。

2 宏組學在瘤胃微生物中的應用

2.1 宏基因組學在瘤胃微生物中應用 宏基因組學是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，以功能基因篩選和測序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結構、進化關系、功能活性、相互協(xié)作關系及與環(huán)境之間的關系為研究目的的新穎微生物研究方法[4]。與其他關于瘤胃微生物群的研究一樣，宏基因組學被用來更好地分析微生物與淀粉酶解、纖維降解、甲烷排放的關系。

瘤胃微生物是反芻動物進行飼草料降解的重要部分。宏基因組學最初的研究是確定反芻動物瘤胃內的微生物主要種類及優(yōu)勢菌群。不同反芻動物在門水平瘤胃微生物優(yōu)勢菌群不同[5-12]（表1），其中大部分是硬壁菌門、擬桿菌門、變形菌門。而對RDP數據庫中所有瘤胃來源的16S rRNA基因序列進行分析，也表明瘤胃中大部分細菌屬于厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門[13]。厚壁菌門是分解纖維的主要菌門，含有大量的降解纖維素的菌屬[14]。

基于宏基因組學方法能夠分析出大量瘤胃微生物功能性基因，在首次進行瘤胃微生物宏基因組學深度測序中，Brulc等[15]發(fā)現了糖苷水解酶和纖維素功能基因。在這之后對瘤胃微生物功能性酶基因的篩選得到了廣泛研究。在海子水牛瘤胃微生物功能基因研究中發(fā)現，有38 011個基因編碼蛋白質具有木質纖維素降解酶活性，其中歸屬于GH2、GH43、GH97、GH3家族的基因較多[16]；在駱駝瘤胃微生物發(fā)現1種新的耐熱木聚糖酶基因（PersiXyn1），在pH 8和40℃下酶活性保持在80%以上[17]。同時瘤胃宏基因組學分析能夠得到較多未被開發(fā)的微生物酶源。在駱駝瘤胃中對附著植物纖維上的微生物進行分析，發(fā)現促進木質纖維素降解和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）發(fā)酵的關鍵物種，表明駱駝瘤胃的微生物群是一種密度很大，仍未被開發(fā)的微生物酶源[18]。對溫室氣體甲烷排放進行研究，通過分析宏基因組學數據發(fā)現了甲烷生成基因mcrA和fmdB與甲烷排放相關[19]。瘤胃微生物宏基因組數據與數據庫中微生物物種和功能進行對比，將是尋找用于工業(yè)相關領域功能性酶基因重要來源之一。

2.2 宏轉錄組學在瘤胃微生物中應用 宏轉錄組學是研究一定時間和空間下細胞轉錄的所有RNA，從轉錄水平上分析特定時期群體生命體的全部基因組轉錄情況以及轉錄調控規(guī)律。相比宏基因組學，宏轉錄組學能夠在表達水平反映瘤胃微生物種類、多樣性和潛在基因功能。Li等[20]應用宏基因組學和宏轉錄組學技術分析表明，RNA水平上的個體間功能變異高于DNA水平。運用宏轉錄組方法對麝牛瘤胃微生物總mRNA進行測序分析，編碼序列與KOG、CAZy以及COG數據庫比對，鑒定出1 000個植物細胞壁降解酶，發(fā)現了893個碳水化合物活性酶，而在宏基因組的測序序列中只發(fā)現了103個碳水化合物活性酶[21]，表明宏轉錄組在微生物活性酶發(fā)現上優(yōu)于宏基因組，能夠發(fā)現更多纖維降解微生物種類及家族基因。在奶牛瘤胃微生物宏轉錄組研究中，發(fā)現糖苷水解酶（GH）家族基因在瘤胃碳水化合物降解中起主要作用，并強調了真菌和纖毛原生動物對多糖降解的重要貢獻[22]。在飼喂玉米秸稈后特定時間下進行瘤胃微生物宏轉錄組分析中，發(fā)現纖維素、半纖維素、寡糖降解過程起主要作用的微生物種類，其中瘤胃球菌屬、纖維桿菌屬和普氏菌屬是主要的植物細胞壁多糖降解菌，瘤胃厭氧真菌中的新美鞭菌屬、梨囊鞭菌屬、根囊鞭菌屬和纖毛原蟲中的前毛蟲屬、多甲多泡毛蟲屬在纖維素和半纖維素降解過程中也發(fā)揮著重要作用[23]。宏轉錄組學和宏基因組學雖能發(fā)現瘤胃微生物的功能作用，但瘤胃內微生物的休眠和凋亡等活動都會使測序結果與實際情況關聯分析出現偏差，這種偏差則需要通過其他組學共同進行矯正。

2.3 宏蛋白質組學在瘤胃微生物中應用 宏蛋白質組學分析是在給定的時間點描述瘤胃微生物群落的基因表達蛋白情況。與宏基因組相比，宏蛋白質組在揭示反芻動物飼料利用效率所涉及的關鍵酶的作用方面更具優(yōu)勢。在瘤胃微生物蛋白質早期研究中，通過富集步驟識別纖維素結合蛋白，分析得到纖維素酶、琥珀酸桿菌、馬氏梭菌的外生葡聚糖酶[24]。隨著測序技術發(fā)展，高性能的MS平臺使用，提供了更先進和更有針對性的蛋白質組測量及高級宏蛋白質組分析[25]。在一項基于2D SDS-PAGE技術研究表明，通過液質聯用測定飼喂高濃縮飼料奶牛中瘤胃消化產物蛋白質，揭示了原核生物蛋白質組主要是參與糖酵解的酶，例如甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、磷酸甘油酸激酶和磷酸丙糖異構酶，其中酶主要來自厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌（Bacteroidetes phyla）；同時發(fā)現產甲烷古菌的酶是最容易識別的蛋白質之一，表明宏蛋白質組學在探索反芻動物低排放表型方面發(fā)揮作用[26]。在一項更詳細的瘤胃微生物宏蛋白質組學研究中，通過對8 163種定量細菌蛋白的分析，發(fā)現有166種不同豐度的碳水化合物活性酶，并且大多數表達的糖苷水解酶屬于57家族和2家族，另外發(fā)現在富含纖維的飲食中，與丁酸酯形成相關的蛋白質比例很高[27]。與宏轉錄組結果相比，宏蛋白質組能夠反映環(huán)境活性微生物的表達。通過對宏蛋白質組學與宏轉錄組學預測的蛋白功能比對分析中，發(fā)現在這些表達的基因中，有71%數據與宏蛋白組相匹配，其中延伸因子Tu、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和磷酸甘油酸激酶與轉錄數據的匹配最為豐富[28]。形成差異的原因可能是實驗技術未能覆蓋到所有微生物，但隨著生物信息學和技術進步樣品的覆蓋率將會得到顯著提高。

表1 瘤胃微生物細菌主要菌群

2.4 宏代謝組學在瘤胃微生物中應用 宏代謝組學是對微生物群落產生的代謝物的系統(tǒng)分析。宏代謝組學常使用核磁共振、液質聯用、氣質聯用、質譜方法和分離技術來分析存在的代謝物，在瘤胃微生物代謝組研究中使用質譜法和液相色譜法是目前應用最廣泛方法，并且由于瘤胃代謝產物的多樣性，可能需要多個實驗平臺進行測定。Saleem等[29-30]和Ametaj等[31]利用各種方法及實驗平臺檢測200多種瘤胃代謝物，包括磷脂、無機離子、氣體、氨基酸、短鏈脂肪酸和碳水化合物等，并結合其他文獻提供的87個代謝相關數據建立瘤胃液代謝物數據庫，包括246種被確認和量化的瘤胃代謝物或代謝物種（對應334種獨特的結構）。瘤胃代謝產物在飼喂不同比例日糧中很容易被區(qū)分。Zhao等[32]通過檢測大量與氮代謝有關的代謝產物，得出代謝物高度依賴于飲食組成，氨基酸代謝物和甲基胺（作為甲基化甲烷生成的底物）有顯著差異。在關于顆粒飼料影響瘤胃上皮代謝物的研究中，發(fā)現顆粒飼料明顯增加瘤胃上皮中8種代謝物的水平，降低了瘤胃上皮組織中7種代謝物的濃度[33]。因此，要深入了解瘤胃微生物代謝物質的產生及如何影響宿主的生理生化變化，宏代謝組學單獨應用并不能解決其問題。

3 宏組學聯合在瘤胃微生物中應用

目前在瘤胃微生物研究中應用宏組學聯合分析還處于起步階段，其中Li等[20]對比宏基因和宏轉錄數據，分析3個品種牛的瘤胃微生物功能活動與飼料利用效率聯系，發(fā)現高、低飼料效率牛的瘤胃微生物特征（如分類群、多樣性指數、功能類別和基因）差異很大，其中飼料利用效率高的牛瘤胃微生物多樣性低于飼料利用效率低的牛，并推測其原因是飼料利用效率高的牛瘤胃微生物產生的代謝物范圍較小，產出用于宿主利用的代謝物質數量增多，可滿足動物的能量需求；而飼料利用效率低的牛瘤胃微生物則相反，并且飼料利用效率低的牛瘤胃微生物可能具有較高的氮代謝，產生更多甲烷氣體，造成能量損失。Shabat等[34]結合宏基因組和代謝組數據對瘤胃微生物群進行了組成、微生物活性和代謝物分析，表明較低豐富度的微生物體基因含量和分類群與較高的飼料效率密切相關，并且微生物群中微生物的特定富集和代謝途徑使動物獲得了更好的能量和碳通道，同時減少了甲烷向大氣的排放，并與Li等[20]推測相同。

在結合3種組學數據分析中，Deusch等[27]將宏基因組、蛋白質組學和代謝組學相結合分析，揭示了普雷沃氏菌科是一個代謝功能廣泛的群體，在濃縮和富含纖維的飼料消化中占據主導地位，并且代謝組學提供了有關瘤胃微生物代謝活動的詳細信息。這項研究為深入了解細菌相互作用的復雜網絡，以及對各種底物的適應提供了更深入的見解。在應用宏組學方法分析飼糧添加劑對瘤胃微生物的影響中，Ogunade等[35]通過對16S rRNA測序和代謝組數據分析發(fā)現酵母補充劑增加了8個纖維分解細菌屬、Anaerovorax和Lachnospiraceae豐度，活酵母補充增加了乙二醇環(huán)己二酮二縮酮和吡喃葡萄糖苷的濃度，并降低了蘇阿糖酸、黃嘌呤核苷、脫氧膽酸、月桂酰肉堿、甲氧基苯甲酸和十五烷基苯甲酸的濃度；bacteroidales BS11，Christensenellaceae R-7和Candidatus saccharimonas與氨基酸生物合成和能量代謝相關代謝物呈正相關。而Belanche等[36]通過體外瘤胃模擬技術，結合宏基因和代謝組學揭示了飼草保存方法和添加維生素E對瘤胃微生物群功能和代謝產物的影響，實驗表明干草日糧可增加細菌多樣性指數。相反，維生素E的補充降低了多樣性指數；同時干草日糧的產甲烷菌多樣性高于青草日糧，但均勻度沒有表現出甲烷菌種類數量的減少；添加維生素E能提高瘤胃發(fā)酵的TVFA和產氣量，當提供乙酸α-生育酚與α-生育酚時原生動物活性較高。以上宏組學聯合分析中，雖提供了微生物與日糧、代謝物之間關系分析方法，但并不能對某種微生物代謝情況進行全面揭示，需要在今后研究中結合相關實驗技術來揭示其功能特征，從系統(tǒng)層面理解瘤胃微生物代謝情況。

4 宏組學數據分析軟件

宏組學數據分析軟件對探究微生物基因功能全面性及深度有重要影響，組學數據擁有較高的數據量，并且測序深度和覆蓋范圍也會影響實驗的結果，合理運用軟件處理大量的組學數據是大部分研究人員關心的問題。目前有較多軟件用于組學數據的分析，在代謝組學和蛋白質組學數據分析中，沃特世推出了LC-MS生物信息學產品Progenesis QI組學分析軟件，此軟件能夠精確地定量分析和鑒定，并發(fā)現樣品中的相關生物標記物[37]。在分析比較代謝組數據軟件研究中，梁丹丹等[38]總結了13種功能軟件基本信息，并著重介紹和對比4種具有代表性軟件用于代謝組學數據分析，包括MAVEN、MZmine、MetaboAnalyst和XCMS Online軟件。而在宏基因組數據比較分析中，第一種被命名為XIPE-TOTEC的工具提供了2個樣本測試，并以宏基因鳥槍法序列作為輸入[39]。對環(huán)境微生物數據分類上，Huson等[40]對Megan進行重寫和擴展，增強了對大型微生物群數據集的分類和功能內容進行交互分析。由于宏組學產生的較多數據信息，數據的產生速度遠高于分析軟件的發(fā)展速度，產生的大量數據未能得到充分分析。因此需要能夠處理整合宏組學分析的工具。目前，FANTOM和MetaComp軟件具有綜合分析形式。FANTOM軟件能夠加強2組宏基因組樣本之間的比較能力，同時，允許探索性和比較分析宏基因組學豐度數據，重要的是，FANTOM可以使用任何層次數據庫，它提供了NCBI分類層次結構，以及KO、COG、PFAM和TIGRFAM數據庫[41]。MetaComp的圖形綜合分析軟件，可對宏基因組學和其他組學數據進行多元統(tǒng)計、雙樣本、多樣本的假設檢驗等分析，并對環(huán)境因素進行新的函數回歸分析[42]。宏組學綜合分析是組學研究的前沿，目前環(huán)境微生物宏組學的綜合分析還未形成統(tǒng)一分析方式，需要相關研究人員不斷探索，為描述微生物之間的關系提供幫助。

5 展 望

反芻動物瘤胃微生物具有復雜性、多樣性等特點，對瘤胃微生物群落、功能、代謝途徑等研究應用宏組學聯合分析具有顯著優(yōu)勢。同時，應將宏組學與其他相關實驗技術結合，全面分析微生物功能作用，用以找尋微生物-代謝物-宿主之間聯系的橋梁及分子途徑，并對其微生物代謝途徑進行干預。隨著高通量測序成本逐漸降低，通過宏組學技術探究反芻動物瘤胃微生物優(yōu)勢菌群、微生物功能的研究勢必會成為主要方向，并向各器官組學、血液和牛奶代謝組學、神經系統(tǒng)等方向發(fā)展，其內部生理代謝途徑和方式將得到解釋，從而更好地揭示日糧、環(huán)境、基因、疾病等對宿主影響。