許 可，趙 靜，劉紅羽，喬立橋，王 軍*，呂文發(fā)*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)教育部國(guó)際合作聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生產(chǎn)與產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130118；3.吉林省德惠市畜牧局岔路口鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，吉林德惠 130300）

睪丸由曲細(xì)精管和間質(zhì)組織組成，曲細(xì)精管是精子發(fā)生的場(chǎng)所。支持細(xì)胞（Sertoli Cell，SC）位于曲細(xì)精管的基底膜上，在睪丸發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[1]。有研究表明支持細(xì)胞具有調(diào)節(jié)精子發(fā)生、形成血睪屏障、為生殖細(xì)胞發(fā)育提供結(jié)構(gòu)和免疫及營(yíng)養(yǎng)支持等功能[2-3]。褪黑激素（N-乙酰基-5-甲氧基色胺，Melatonin，MT）是一種主要由哺乳動(dòng)物松果體合成分泌的激素[4]。有研究報(bào)道褪黑素直接作用于睪丸體細(xì)胞，局部調(diào)節(jié)間質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)分泌活動(dòng)，在支持細(xì)胞中，褪黑素影響細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、能量代謝和氧化狀態(tài)[5]。Yang等[6]研究證明，在牛支持細(xì)胞中，褪黑素上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1，下調(diào)P21的mRNA水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育，而褪黑素對(duì)雛雞睪丸支持細(xì)胞的作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用油紅O、免疫熒光法和RT-PCR法鑒定雛雞睪丸支持細(xì)胞，利用Cell Counting Kit-8（CCK-8）、EdU和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)不同濃度褪黑素處理雛雞睪丸支持細(xì)胞48 h后，對(duì)其細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖能力和增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響，明確褪黑素對(duì)雛雞睪丸支持細(xì)胞增殖的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 雛雞（吉林省德惠市）；膠原酶Ⅳ、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、油紅O、Triton X-100（索萊寶科技有限公司）；4%多聚甲醛（華程生物技術(shù)有限公司）；蘇木精（欣華綠源科技有限公司）；BSA（AMRESCO）；vimentin 抗 體（Sigma）；褪黑素（Sigma）；BeyoClickTM EdU（碧云天生物技術(shù)有限公司）；總RNA 提取試劑Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）；熒光定量PCR試劑盒（上海基星生物科技有限公司）；引物合成（生工生物工程股份有限公司）。

1.2 雛雞睪丸支持細(xì)胞提取及純化 取20日齡健康雛雞，處死后，獲取睪丸，PBS清洗3次，在超凈臺(tái)內(nèi)用鑷子剝?nèi)グ啄?，將睪丸組織剪碎，PBS清洗至液體清澈；加入1 mg/mL膠原酶Ⅳ，37℃消化50 min，1 000 r/min離心3 min，棄上清液；加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化6 min，收集細(xì)胞懸液，加入完全培養(yǎng)液終止消化，300目細(xì)胞篩過(guò)濾；重復(fù)用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，直至消化完全；收集過(guò)濾液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，分入培養(yǎng)皿中，2 h后進(jìn)行換液，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后，利用低滲法（PBS:蒸餾水=1:2）進(jìn)行細(xì)胞純化。

1.3 油紅O染色 將中皿細(xì)胞在體外培養(yǎng)一段時(shí)間后，棄去培養(yǎng)液，用PBS緩沖的4%多聚甲醛在4℃下固定細(xì)胞1 h，用PBS洗滌2次，在室溫下用稀釋的油紅O濾液（現(xiàn)配現(xiàn)用）染色30 min。棄去染料，用60%乙醇分色5 s，自來(lái)水洗滌。將細(xì)胞用蘇木精復(fù)染30 s，用自來(lái)水洗滌至藍(lán)色，立即用光學(xué)顯微鏡觀察，捕獲圖像。

1.4 免疫熒光 將1.5×105個(gè)/孔細(xì)胞在24孔板中培養(yǎng)24 h進(jìn)行細(xì)胞爬片。將細(xì)胞用PBS洗滌3次，PBS緩沖的4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗滌3次，1% Triton X-100通透液室溫孵育15 min。PBS洗滌3次，1%BSA室溫封閉30 min，PBS洗滌3次，加入波形蛋白抗體，4℃孵育過(guò)夜。PBS洗滌細(xì)胞6次，山羊抗兔抗體避光孵育2 h。PBS避光洗滌細(xì)胞6次，Hoechst33258避光孵育15 min。然后，用PBS避光洗滌細(xì)胞6次，封片。在多功能細(xì)胞成像儀下觀察，捕獲圖像。

1.5 RT-PCR及瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn) 采用Trizol法提取雛雞睪丸支持細(xì)胞的總RNA，根據(jù)TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-PCR反應(yīng)體系：Premix Taq 10 μL、Forward primer 0.5 μL、Reverse primer 0.5 μL、cDNA 3 μL、RNase-free H2O至20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；59℃退火30 s；72℃延伸1 min、35個(gè)循環(huán)；72℃徹底延伸10 min。得到PCR產(chǎn)物后，配制1%瓊脂糖凝膠并進(jìn)行電泳，在成像儀下觀察，捕獲圖像。PCR引物見表1。

1.6 CCK-8試驗(yàn) 將2×104個(gè)/孔細(xì)胞接種至96孔板中，每孔加入100 μL培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。褪黑素處理支持細(xì)胞48 h后，每孔加入12 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值。

表1 基因引物序列

1.7 BeyoClickTMEdU染色 將1.5×105個(gè)/孔細(xì)胞在24孔板中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞爬片。褪黑素處理支持細(xì)胞后，加入與培養(yǎng)液等量的2×EdU工作液，37℃孵育2 h。去除培養(yǎng)液，加入PBS緩沖的4%多聚甲醛室溫固定15 min，洗滌液（含3%BSA的PBS）洗滌3次。加入含0.3% Triton X-100的PBS通透液室溫孵育15 min，洗滌液洗滌2次。加入Click反應(yīng)液（按順序配制后15 min內(nèi)使用）室溫避光孵育30 min，洗滌液洗滌3次。加入1×Hoechst 33342室溫避光孵育10 min，洗滌液洗滌3次，去除洗滌液，封片。在多功能細(xì)胞成像儀下觀察，捕獲圖像。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）采用Trizol法提取雛雞睪丸支持細(xì)胞的總RNA，根據(jù)TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體 系：2×RealStar Green Fast Mixture 10 μL、Forward primer 0.5 μL、Reverse primer 0.5 μL、cDNA 1 μL、RNase-free H2O至20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，40個(gè)循環(huán)；退火34 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。運(yùn)用 2－△△Ct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。熒光定量PCR引物見表2。

表2 基因引物序列

1.9 統(tǒng)計(jì)分析 采用Graph Pad Prism 5.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，比較各組之間的差異，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 支持細(xì)胞的鑒定 通過(guò)油紅O染色、免疫熒光染色和RT-PCR實(shí)驗(yàn)來(lái)鑒定體外純化后培養(yǎng)的支持細(xì)胞。油紅O染色（圖1-A）發(fā)現(xiàn)，脂滴被染成紅色，蘇木精復(fù)染，細(xì)胞核被染成藍(lán)色，核內(nèi)見有支持細(xì)胞特有的雙極小體結(jié)構(gòu)。免疫熒光染色（圖1-B）顯示，細(xì)胞核呈藍(lán)色，在支持細(xì)胞中特異表達(dá)的波形蛋白呈綠色，并且波形蛋白陽(yáng)性細(xì)胞比例達(dá)到94%。RT-PCR結(jié)果（圖1-C）顯示，在支持細(xì)胞中標(biāo)志基因SOX9和GATA4均表達(dá)。

2.2 CCK-8檢測(cè)支持細(xì)胞活力 如圖2所示，與對(duì)照組相比，1 000 nmol/L濃度褪黑素組顯著增加支持細(xì)胞細(xì)胞活力（P＜0.05）。

2.3 EdU檢測(cè)支持細(xì)胞增殖能力 EdU染色結(jié)果顯示（圖3），增殖細(xì)胞呈綠色熒光，與對(duì)照組相比，1 000 nmol/L褪黑素組增加了EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例（P＜0.01），表明褪黑素可促進(jìn)支持細(xì)胞增殖。

2.4 熒光定量檢測(cè)支持細(xì)胞增殖水平 如圖4所示，與對(duì)照組相比，1 000 nmol/L褪黑素組PCNA、Cyclin BmRNA表達(dá)量升高（P＜0.05），不同濃度褪黑素組Cyclin D基因表達(dá)量均升高（P＜0.05），P21基因表達(dá)量下降（P＜0.05）。這些結(jié)果表明，褪黑素促進(jìn)支持細(xì)胞增殖，與CCK-8、EdU檢測(cè)結(jié)果一致。

3 討 論

根據(jù)睪丸支持細(xì)胞的特征，睪丸支持細(xì)胞的鑒定方法包括H.E.染色、油紅O染色、吖啶橙染色、羅丹明123染色、免疫熒光、免疫組化和RT-PCR等方法[7-9]。本實(shí)驗(yàn)采用油紅O染色、免疫熒光和RT-PCR 3種方法進(jìn)行細(xì)胞鑒定，油紅O結(jié)果顯示睪丸支持細(xì)胞核周圍存在脂滴，細(xì)胞核內(nèi)有雙極小體。王帥等[7]研究表明，脂滴和雙極小體均是支持細(xì)胞所特有的結(jié)構(gòu)。免疫熒光結(jié)果顯示94%的細(xì)胞波形蛋白陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中。在睪丸曲細(xì)精管中，波形蛋白特異地表達(dá)于支持細(xì)胞[10]。RT-PCR結(jié)果顯示在支持細(xì)胞中標(biāo)志基因SOX9和GATA4均表達(dá)，與李欣等[11]的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證明純化后細(xì)胞培養(yǎng)物主要為支持細(xì)胞。

睪丸支持細(xì)胞的增殖水平影響睪丸的生精功能和體積[1]。已有研究表明，褪黑素對(duì)細(xì)胞具有促增殖作用[5]，而關(guān)于褪黑素對(duì)雛雞支持細(xì)胞增殖的影響尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，1 000 nmol/L褪黑素處理支持細(xì)胞48 h可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，其表現(xiàn)為細(xì)胞活力、EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例和增殖相關(guān)基因表達(dá)量（PCNA、Cyclin D、Cyclin B）增加，P21的mRNA水平下降，結(jié)果表明褪黑素可以促進(jìn)雛雞支持細(xì)胞的增殖。

研究表明，褪黑素對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響依賴于其濃度、暴露時(shí)間和細(xì)胞類型[12-13]。細(xì)胞增殖核抗原（PCNA）是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的標(biāo)記物，主要表達(dá)于S期，細(xì)胞周期蛋白抑制劑P21通過(guò)與PCNA相互作用影響細(xì)胞周期進(jìn)程[14]。Cyclin D是G0/G1到S期轉(zhuǎn)變所需的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK4和CDK6的調(diào)節(jié)亞單位[15]。本研究中褪黑素可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞從G1到S期的進(jìn)程而影響支持細(xì)胞的生長(zhǎng)，與Li等[16]在GC-1 spg細(xì)胞中的褪黑素研究結(jié)果相同。

褪黑素的促增殖作用已在多種細(xì)胞中顯示。已有研究報(bào)道，褪黑素通過(guò)核受體RORα促進(jìn)單色光誘導(dǎo)的胸腺中T淋巴細(xì)胞的增殖[17]。同時(shí)，褪黑素可以通過(guò)褪黑素受體1a和1c促進(jìn)肉雞中單色光誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖[18]。在患有缺氧缺血性腦損傷的新生大鼠中，褪黑素還可促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖[19]。Niu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素通過(guò)激活ERK1/2信號(hào)通路從而刺激支持細(xì)胞中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）的產(chǎn)生，促進(jìn)山羊精原干細(xì)胞（SSC）的增殖。Yang等[6]研究證明，褪黑素也可調(diào)節(jié)牛支持細(xì)胞的發(fā)育和功能。此外，在小鼠精原細(xì)胞中，褪黑素通過(guò)增加金屬硫蛋白-2（Mt2）的表達(dá)促進(jìn)GC-1 spg細(xì)胞增殖，抑制Mt2后，褪黑素的促增殖作用被逆轉(zhuǎn)，并且還證明了細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）途徑參與了褪黑素促進(jìn)的GC-1 spg細(xì)胞增殖[16]。Heo等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在間充質(zhì)干細(xì)胞中，褪黑素通過(guò)誘導(dǎo)SRY盒轉(zhuǎn)錄因子2基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的增殖和防止細(xì)胞復(fù)制性衰老。同樣，褪黑素在治療缺氧的神經(jīng)干細(xì)胞中有很重要的作用，可以增加細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞死亡，并增強(qiáng)神經(jīng)元細(xì)胞分化，但不影響星形膠質(zhì)細(xì)胞分化[22]。這些研究都表明褪黑素對(duì)細(xì)胞具有促增殖作用，與本研究結(jié)果相同。然而，褪黑素通過(guò)多種調(diào)控機(jī)制來(lái)發(fā)揮促增殖作用，其發(fā)生的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)成功分離培養(yǎng)和鑒定雛雞睪丸支持細(xì)胞，并證明褪黑素可以促進(jìn)雛雞睪丸支持細(xì)胞體外增殖。