許 娜 陳 玲 馬玉涵 劉 超 董榮榮 姜 浩

(1安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院/茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230036;2 安徽科技學(xué)院生命與健康科學(xué)學(xué)院,安徽 鳳陽 233100)

茶葉為山茶科山茶屬植物茶[Camellia sinensis(L.) O.Kuntze]的干燥嫩葉,具有重要的經(jīng)濟(jì)、藥理和文化屬性。茶葉起源于中國,在我國被譽(yù)為“國飲”,有著悠久的種植和飲用歷史[1]。全世界有58個(gè)國家和地區(qū)種茶,有30億人口飲茶,茶葉已成為位居世界三大非酒精飲品之首。茶葉按照發(fā)酵工藝可分為非發(fā)酵茶、半發(fā)酵茶、發(fā)酵茶和后發(fā)酵茶四大類;按照加工工藝和產(chǎn)品特性則分為綠茶、白茶、黃茶、烏龍茶、紅茶和黑茶六大類[2]?；瘜W(xué)成分是評價(jià)茶葉特性的物質(zhì)基礎(chǔ),其各成分間的比例是茶葉感官品質(zhì)的具體表征[3]。不同的茶樹品種、生長環(huán)境和加工工藝均會對茶葉品質(zhì)及其化合物組成[4]產(chǎn)生影響。茶葉的品質(zhì)不僅影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值,也決定其藥理功能[5]。茶葉含有的典型功能活性成分包括茶多酚、茶多糖、生物堿等,這些組分構(gòu)成“復(fù)方藥劑”[6],綜合決定了茶葉的降血糖、調(diào)控血脂、改善糖尿病和心腦血管疾病以及預(yù)防癌癥的功效[7]。

茶葉質(zhì)量安全準(zhǔn)入制度的實(shí)施,對其品質(zhì)鑒定和檢測提出了更高的要求。茶葉化學(xué)成分的定性/定量分析常用的檢測方法雖詳實(shí)有效,但也存在一定局限性。例如采用分光光度法測定茶多糖、茶多酚含量,茶水本身顏色也會對檢測結(jié)果有一定影響;采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)測定兒茶素類含量,對實(shí)驗(yàn)室硬件和操作人員技能要求較高[8];較多文獻(xiàn)也報(bào)道了各種成品茶葉中多酚和嘌呤堿含量的分析方法,但這些方法通常較復(fù)雜[9-10]。上述常規(guī)檢測方法均屬于化學(xué)分析法,需要對樣本進(jìn)行預(yù)處理,雖然分析精度高,但分析過程復(fù)雜,耗時(shí)費(fèi)力,技術(shù)要求和檢測成本高,且易造成環(huán)境污染。因此,尋找一種能用于茶葉市場中常規(guī)、快速、簡便的檢測分析方法,符合市場迫切需求,具有重要的社會價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

傅里葉變換中紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)技術(shù)基于樣本分子的吸收頻率,從而對物質(zhì)分子基團(tuán)、化學(xué)鍵等化學(xué)特性進(jìn)行分析,此方法具有樣本前處理操作簡單,分析速度快,環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用到食品質(zhì)量檢測中,在茶葉質(zhì)量評估、摻假檢測領(lǐng)域的研究也逐漸增多[11-13],也被用于茶葉的產(chǎn)地檢測[14]。隨著茶葉市場中茶飲料、冷泡茶、速溶茶粉等產(chǎn)品的大量涌現(xiàn),而有關(guān)茶湯化學(xué)品質(zhì)分析、茶湯與茶葉化學(xué)成分比較的相關(guān)研究較缺乏。因此本研究首先基于不同茶類FTIR 光譜差異,評價(jià)不同茶類主要化學(xué)成分差異,并對不同茶類進(jìn)行聚類分析,為判斷樣品光譜特征性區(qū)間和峰位指明方向;同時(shí)基于茶葉與其對應(yīng)茶湯的FTIR 光譜分析,探討茶葉沖泡前后主要化學(xué)成分的溶出率差異,及茶葉種類對各茶葉小分子化合物溶出的影響,旨在為市場中茶葉、速溶茶粉等產(chǎn)品化學(xué)品質(zhì)鑒別及色澤品評提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

7個(gè)供試茶樣購于2015年,全部為合肥市場市售茶葉,分別是黃山毛峰(綠茶,安徽)、安吉白茶(綠茶,安徽)、白牡丹(白茶,福建)、抱兒鐘秀(黃大茶,安徽)、亨大蘭花(黃大茶,安徽)、天方安茶(黑茶,安徽)、祁門紅茶(紅茶,安徽)。

10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品(峰面積歸一化法下純度均大于98%):沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate,GCG)、表兒茶素(epecatechin,EC)、兒茶素(catechin,C)、咖啡堿(caffeine,CAFF)和可可堿(theobromine,THB)購于合肥一力生物公司;表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate,ECG)、沒食子酸(gallic acid,GA)、沒食子酸兒茶素(gallocatechin,GC)和表沒食子兒茶素(epigallocatechin,EGC)購于西安玉泉生物公司。乙腈和甲醇均為色譜純,購于美國Tedia 公司;其余試劑均為分析純,購于國藥集團(tuán)。

1.2 茶湯凍干粉的制備

取茶葉100 g 粉碎,按1∶30 固液比添加煮沸蒸餾水,70℃保持15 min,8 000 r·min-1離心10 min 收集上清茶湯,-40℃凍結(jié)并真空冷凍干燥(升華干燥參數(shù):冷阱溫度-45℃、真空度60 Pa),制得干粉備用[15]。7種茶樣的茶湯凍干粉得率分別為:黃山毛峰(24.3%)、安吉白茶(24.8%)、白牡丹(24.1%)、抱兒鐘秀(22.7%)、亨大蘭花(23.6%)、天方安茶(16.4%)、祁門紅茶(24.9%)。

1.3 茶葉和茶湯浸提物的FTIR 光譜采集及曲線擬合

樣品干粉過200目篩,精確稱取2.0 mg,加0.2 g光譜純干燥KBr 晶體,紅外燈烘烤下于瑪瑙研缽中研磨至細(xì)粉狀,置于模具中。抽氣加壓20 MPa,維持3 min,成半透明錠片,于20℃條件下進(jìn)行FTIR 掃描(MPA,德國Bruker)。掃描范圍4 000～400 cm-1,掃描32 次,分辨率4 cm-1。同一樣品隨機(jī)測定3 次,取平均值,并對獲得的光譜進(jìn)行歸一化處理,以消除每次壓片厚度不同對光譜的影響[16]。利用Omnic 8.0軟件進(jìn)行后續(xù)分析,用光譜分析擬合軟件Peakfit 4.0對測定樣品光譜曲線進(jìn)行擬合,baseline 選擇linear D2,Peak Type 選擇Gauss Amp[17]。

1.4 樣品茶多糖、可溶性總糖、總茶多酚、總游離氨基酸、兒茶素類和生物堿類物質(zhì)含量測定

采用蒽酮-硫酸法測定樣品茶多糖和可溶性總糖含量[18-19];福林酚比色法測定樣品總茶多酚含量[8],所有樣品獨(dú)立測定6 次。樣品中游離氨基酸的測定采用L-8900 全自動氨基酸分析儀(日本Hitachi),該方法可鑒定出38種氨基酸及其衍生物。制樣步驟:取0.2 g 樣品,加10 mL 100℃水浸提5 min,取浸提液0.5 mL,加4%磺基水楊酸酸解,12 000 r·min-1離心20 min,取上清過0.22 μm 水相膜,20 μL 進(jìn)樣測定。所有樣品獨(dú)立測定3 次,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度計(jì)算樣品中各種氨基酸含量,樣品中總游離氨基酸含量記為所有38種氨基酸及其衍生物的總和[20]。

參考GB/T 8313-2018 檢測茶葉中兒茶素、咖啡堿類化合物[8]。參考Zhang 等[21]的方法測定樣品中兒茶素、生物堿等10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物含量,并稍作改進(jìn),采用1260 高效液相色譜儀(美國Agilent),Agilent ZORBAX SB-Aq C18 色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,美國)測定。以進(jìn)樣量中各成分質(zhì)量對相應(yīng)峰面積作圖,制作10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線,在10 ng～50 μg之間呈良好的線性關(guān)系[22]。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖譜見圖1。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行Student’s t-test顯著性分析,P＜0.05為差異顯著。采用GraphPad Prism 5軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉與茶湯的FTIR 光譜圖及聚類分析

圖1 HPLC 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖譜Fig.1 Standard curve of HPLC

圖2 茶葉及茶湯的FTIR 光譜圖Fig.2 The FTIR spectra of tea leaves and tea beverages

由圖2可知,不同茶葉與其對應(yīng)茶湯的光譜圖雖有相似之處,但也存在一些明顯差別。其中茶葉的特征性峰位于3 306、2 922、2 852～2 855、1 648、1 534、1 451、1 367、1 238、1 147和1 103 cm-1;茶湯的特征性峰位于3 300、2 924～2 925、1 700、1 643、1 451、1 364、1 451、1 364、1 238、1 146和1 039 cm-1。不同茶葉與茶湯峰形的典型差別區(qū)域位于2 925/2 855 cm-1、1 700 cm-1和1 534 cm-1附近峰位的狹窄區(qū)域,表明干茶葉與開水沖泡茶湯的化學(xué)成分有明顯差異。

為分析FTIR 光譜數(shù)據(jù)中的位置信息,尋找不同茶類的代表峰區(qū),對不同茶類光譜進(jìn)行聚類分析。對茶葉和茶湯樣品光譜數(shù)據(jù),選取譜段1 800～1 170 cm-1預(yù)處理,處理方式為一階導(dǎo)數(shù)。由圖3可知,茶葉和茶湯的聚類趨勢基本一致,由加工工藝決定的茶葉分為兩大類:一類是非發(fā)酵的綠茶、白茶,另一類為發(fā)酵的黃茶、紅茶、黑茶;再進(jìn)一步,綠茶(黃山毛峰和安吉白茶)、黃茶(亨大蘭花和抱兒鐘秀)各自聚為一類。聚類分析結(jié)果表明,1 800～900 cm-1區(qū)域是區(qū)分不同茶類的主要光譜范圍。因此,后續(xù)主要針對樣品光譜差 異 明 顯的2 925/2 855 cm-1、1 700 cm-1和1 534 cm-13個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)果分析。

2.2 茶葉與茶湯在2 925/2 855 cm-1區(qū)段光譜峰差異解析

在測定的所有樣品中,與茶葉波峰相比,茶湯在2 955 cm-1峰位明顯降低、在2 855 cm-1峰位降至肉眼不可見(圖2)。這是由于2 925/2 855 cm-1區(qū)域是CH2反對稱/對稱伸縮振動的特征性峰位[23-24],屬于脂類化合物。茶葉中脂類物質(zhì)廣泛存在,而在沖泡過程中脂類難溶于水,因而造成茶湯在2 925/2 855 cm-1區(qū)域特征峰位降低。表明茶葉中所含的脂溶性成分,經(jīng)開水沖泡后仍難以溶解于茶湯中。

圖3 茶葉及茶湯FTIR 光譜的聚類分析Fig.3 FTIR spectrum cluster analysis of leaves and tea beverages

2.3 茶葉與茶湯在1 700 cm-1峰位差異解析

1 700 cm-1峰作為C=O和C=C 伸縮振動位點(diǎn),可能來源化合物為氨基酸、糖類或茶多酚,在所測定的茶葉及相應(yīng)茶湯樣品中此峰區(qū)存在差異,表明茶葉與茶湯含有的這三類化合物存在差異。聶志矗[25]對茶葉中氨基酸單體進(jìn)行FTIR 光譜分析發(fā)現(xiàn),茶氨酸(占氨基酸含量50%以上)、谷氨酸和酪氨酸的C=O 伸縮振動均與1 700 cm-1距離較遠(yuǎn),其中茶氨酸的波峰位于1 647 cm-1。胡皆漢等[26]研究表明,雖然-COOH 伸縮振動位于1 701 cm-1附近,但氨基酸看不到任何譜帶。因此,本試驗(yàn)分析了糖類的FTIR 光譜圖,包括幾種單糖、不可溶/可溶性葡聚糖。由圖4-a可知,無論是葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖等單糖,還是葡聚糖,在1 701 cm-1均未出現(xiàn)明顯譜峰;而兒茶素類和CAFF的FTIR 光譜檢測結(jié)果表明,EGCG、ECG、GA和CAFF 因分子中含有的-COO-或C=C 基團(tuán),在1 700 cm-1附近均有典型的特征性峰位出現(xiàn)(圖4-b)。以上結(jié)果表明,茶葉與茶湯在1 700 cm-1光譜峰的差異,是由兒茶素類和CAFF 分子引起的,也證明茶葉沖泡過程中有兒茶素類和CAFF的溶出。

圖4 糖類(a)、兒茶素類和CAFF 單體(b)的FTIR 光譜圖Fig.4 FTIR spectrogram of carbohydrate (a),catechin and caffeine monomer (b)

2.4 茶葉與茶湯在1 534 cm-1峰位差異解析

由圖2和圖5可知,茶葉樣品在1 534 cm-1特征峰位清晰,但茶湯的光譜中此峰位不明顯,進(jìn)一步光譜擬合后,可以更清楚地看到二者之間的差別(圖6)。1 534 cm-1峰位對應(yīng)葉綠素a與Mg 原子中心5 價(jià)配位鍵結(jié)合[27],說明茶葉沖泡過程中,葉綠素作為脂溶性成分,難以溶出,因此在茶湯中的含量比茶葉中明顯降低,造成了茶湯光譜中1 534 cm-1峰位的缺失。紅茶和綠茶茶湯在此位置相對高度不同,表明2種茶湯在色澤上存在差異。

圖5 茶葉及茶湯樣品在1 800～900 cm-1段FTIR 光譜圖Fig.5 The FTIR spectra of tea leaf and tea beverage samples in the 1 800～900 cm-1 region

圖6 黃山毛峰與祁門紅茶在1 573～1 487 cm-1光譜區(qū)域FTIR 分峰結(jié)果Fig.6 The results of FTIR in the spectral region of 1 573～1 487 cm-1 were obtained by Huangshan maofeng and Keemun tea

不同茶葉品種的光譜在1 534 cm-1峰位也存在明顯差異,綠茶在此位點(diǎn)的峰明顯高于紅茶。這是由于綠茶加工過程中的殺青工藝,導(dǎo)致茶葉中的酶失活、葉綠素未脫鎂,從而保存了更多的含鎂葉綠素,此外綠茶未經(jīng)發(fā)酵從而降低了葉綠素被微生物降解的比例,因此在5種茶中綠茶的葉綠素保留最為完整(1 534 cm-1波峰最高)。而紅茶在揉制過程中,葉綠素脫鎂,使得紅茶顏色呈現(xiàn)紅褐色。黑茶在全發(fā)酵過程中葉綠素被微生物分解,導(dǎo)致發(fā)酵型茶中葉綠素含量較低,形成各自獨(dú)有的顏色,也造成了在1 534 cm-1位置峰型的差異。因此,1 534 cm-1特異性波峰可以作為判斷不同茶葉加工方式的定性分析標(biāo)準(zhǔn)之一。

在1 534 cm-1峰區(qū)還存在另外3個(gè)峰位變化,分別是1 551/1 556 cm-1、1 500/1 497 cm-1和1 516/1 517 cm-1。其中,1 551/1 556 cm-1和1 500/1 497 cm-1與葉綠素有關(guān),為葉綠素中亞甲基橋的伸縮振動[28]。由圖6可知,綠茶茶葉在這2個(gè)峰位均高于紅茶茶葉。1 516/1 517 cm-1為木質(zhì)素中的苯環(huán)C=C 伸縮振動[29],茶湯無法溶解木質(zhì)素,光譜中也顯示這一峰位明顯低于茶葉。

2.5 樣品中總茶多酚、茶多糖、可溶性糖、總游離氨基酸等的定量分析

由圖7可知,在茶葉和茶湯所含干物質(zhì)中,茶多酚占據(jù)首要地位,也是茶葉風(fēng)味的主要來源;其次是可溶性糖,對茶葉和茶湯口感也有重要影響;而總游離氨基酸含量在茶葉中較低,與茶多糖相當(dāng)。氨基酸極易溶于水,其在茶湯中易富集,是決定茶湯鮮爽滋味的另一類重要組分。茶葉中單一兒茶素類的含量往往高于總游離氨基酸或茶多糖的含量(圖7、圖8),因此對中紅外光譜影響尤為重要;而茶多糖和總游離氨基酸因含量相對較低,對FTIR 光譜的影響較小,印證了茶葉與茶湯在1 700 cm-1峰位差異是由兒茶素類,而不是由茶多糖或氨基酸的含量差異引起的。

EGCG含量由茶葉中的33.5 mg·g-1(7種茶葉平均值)提升至茶湯中的64.9 mg·g-1(7種茶葉平均值);CAFF含量從26.5 mg·g-1(7種茶葉平均值)提升至85.4 mg·g-1(7種茶葉平均值)。一般在茶葉中EGCG和CAFF含量占總多酚的58%～74%之間,是茶葉多酚中的主要化合物。比較黃山毛峰的茶葉與茶湯,EGCG 從77.6 mg·g-1上升至116.7 mg·g-1,CAFF從36.3 mg·g-1上升至87.4 mg·g-1(圖8)。表明茶葉沖泡過程中兒茶素和生物堿有效溶出,大量的EGCG、CAFF、ECG 等單體溶出進(jìn)入茶湯,茶多酚在茶湯干粉中得到富集,含量明顯提升。

圖7 茶葉和茶湯中總茶多酚、茶多糖、可溶性糖、總游離氨基酸及其他物質(zhì)含量Fig.7 The tea polyphenols,polysaccharides,soluble sugar and other substances in tea leaf and tea beverage samples

圖8 茶葉和茶湯中兒茶素類和生物堿含量Fig.8 The content of catechins and alkaloids in tea leaf and tea beverage samples

3 討論

FTIR 作為分析分子振動規(guī)律的檢測手段,可以在不破壞原有樣品的前提下對微量樣品進(jìn)行分析[30]?；贔TIR 技術(shù)在探知物質(zhì)內(nèi)在組成和含量方面的獨(dú)特優(yōu)勢,可以快速高效的檢測到樣品中化合物含量的變化。如李曉麗等[31]利用FTIR對茶葉中非法添加滑石粉進(jìn)行了檢測分析;也有研究利用FTIR 光譜對茶葉加工過程進(jìn)行監(jiān)控,如李棟玉等[12]對普洱熟茶陳化過程進(jìn)行研究;還可以利用FTIR對不同年份的茶葉進(jìn)行鑒定等[32]。

在光譜分析中,聚類分析法和判別分析法是兩種可相互補(bǔ)充的方法。吳全金等[33]對烏龍茶、綠茶、紅茶和白茶開展判別分析,采用Wilks’ Lambda 判別模型,以1 000～1 800 cm-1波段中篩選獲得的譜峰的吸收值建立了每個(gè)茶類的特定判別函數(shù),可應(yīng)用于對未知茶類的判別,但也存在一定的局限,如所需選峰位多達(dá)12個(gè),而且對所選峰位歸屬、針對不同茶類的光譜特征差異并未解析;此外,這種一分為二的判別方法無法闡明茶類之間的“親緣”關(guān)系,而本研究所采用的聚類分析法則是一種較好的補(bǔ)充。本研究在對不同茶類聚類分析時(shí),選用光譜范圍為1 800～1 170 cm-1,該區(qū)域比胡燕等[14]的選擇更狹窄;同時(shí)包含了本研究中前述的各特征區(qū)域,可作為區(qū)分不同茶類,以及茶葉與對應(yīng)茶湯的特征性位點(diǎn)。

與以往的聚類分析不同,本研究不僅對樣品特征峰位進(jìn)行了指認(rèn),所選特征峰位包含脂類、兒茶素類、CAFF和葉綠素等與茶類特征密切相關(guān)的典型峰位;還對茶葉加工過程中內(nèi)含物的理化變化和光譜差別機(jī)理進(jìn)行了探索。通過光譜曲線擬合對比分析茶葉和茶湯的光譜信息,確定它們的特征性峰位在2 925/2 855 cm-1、1 700 cm-1和1 534 cm-1狹窄區(qū)域。2 925/2 855 cm-1區(qū)域代表脂類飽和烴鏈-CH2振動,而脂類物質(zhì)難溶于水,因此經(jīng)沖泡后的茶湯在此位點(diǎn)的峰形明顯低于茶葉。1 700 cm-1峰位對應(yīng)化合物是兒茶素類和CAFF,這些水溶性物質(zhì)在茶湯中大量溶出,構(gòu)成了茶湯的主要色澤、滋味及健康功效成分。而兒茶素類和CAFF 在茶湯干粉中得到了富集,因此在此位點(diǎn)茶湯的峰形明顯高于茶葉。1 534 cm-1和1 516/1 517 cm-1特征峰位分別對應(yīng)葉綠素和木質(zhì)素。樣品在該位點(diǎn)的峰形和走勢不同,體現(xiàn)了不同茶葉加工工藝所造成的不同茶類中葉綠素含量的差異,以及木質(zhì)素難溶于茶湯的溶解特性。

1 700 cm-1峰位對應(yīng)樣品中兒茶素類和CAFF含量變化,此結(jié)果得到了羅婧等[34]的研究證實(shí)。而Breton[27]和Sato 等[28]研究表明1 534 cm-1峰位與葉綠素分子振動有關(guān),Butler 等[35]表明1 534 cm-1峰位的降低代表葉綠體的降解,表征著植物的衰老。紅茶在鞣制發(fā)酵過程中葉綠素脫鎂,導(dǎo)致其葉綠素含量降低,因而其FTIR 光譜在1 534 cm-1位點(diǎn)峰形較低,所以1 534 cm-1峰位特征可用于定性分析不同加工工藝的茶葉。以往光譜學(xué)研究往往以干茶葉為研究對象,缺乏對沖泡后茶湯內(nèi)含物的分析,考慮到現(xiàn)實(shí)生活中泡茶方式的廣泛使用,茶湯的化學(xué)品質(zhì)及其理化狀態(tài)是一個(gè)重要是營養(yǎng)學(xué)問題。本研究詳細(xì)對比分析了茶葉、茶湯的化學(xué)品質(zhì),具有重要的指導(dǎo)實(shí)踐和社會意義,且從側(cè)面佐證了篩選的3個(gè)特征峰的歸屬。

4 結(jié)論

本研究采集茶葉和茶湯FTIR 光譜數(shù)據(jù),對1 800～900 cm-1峰區(qū)聚類分析,建立了一種基于FTIR的快速茶葉分類方法。通過光譜曲線擬合,探明了茶葉與茶湯的特征性峰位為2 925/2 855 cm-1、1 700 cm-1和1 534 cm-1;并進(jìn)一步結(jié)合化合物單體的光譜信息,解析了不同茶類差異峰位的化合物來源包含脂類、兒茶素類/CAFF、葉綠素和木質(zhì)素。本研究采用的FTIR 光譜分析法可作為判別分析和化學(xué)測定的有效補(bǔ)充,實(shí)現(xiàn)茶葉/茶湯化學(xué)品質(zhì)分析、茶湯色澤審評的快速定性分析,為茶葉市場的大量檢測需求,特別是新型速溶茶粉的質(zhì)量檢測提供一種簡便、可行的方法。