李 星, 林祥龍, 孫在金, 趙 龍, 何 飛, 韓 穎*， 侯 紅*

1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院， 四川 綿陽 621010 2.中國環(huán)境科學(xué)研究院， 環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評估國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100012 3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院， 云南 昆明 650201

Cu是廣泛存在于自然界中的重金屬元素之一，是生物生命活動的必需元素，但過量的Cu會對生態(tài)受體的生長發(fā)育造成威脅，甚至導(dǎo)致其死亡[1-2]. 隨著采礦冶煉、污泥傾倒、農(nóng)藥化肥的使用、電子廢棄物拆解和畜糞入田等人類活動的加劇，土壤Cu污染日益嚴(yán)重[1]. 2014年《全國土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，Cu的點(diǎn)位超標(biāo)率為2.1%[3].

跳蟲是典型的土壤無脊椎動物，廣泛分布于土壤中，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中扮演關(guān)鍵角色(分解有機(jī)質(zhì)和促進(jìn)養(yǎng)分循環(huán)等)[4-5]. 在污染土壤中白符跳的暴露途徑也可指示土壤環(huán)境的質(zhì)量，是一種重要指示性動物之一[6]. 研究表明，與蚯蚓相比，跳蟲對污染物毒性響應(yīng)更敏感[5]. 跳蟲種類繁多，其中，白符跳(Folsomiacandida)具有生長周期短、繁殖快等優(yōu)勢，在生態(tài)毒理試驗(yàn)中應(yīng)用較為廣泛且技術(shù)較為成熟，而且已被國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)規(guī)定為模式生物[6].

重金屬毒性閾值的研究可以為土壤重金屬生態(tài)基準(zhǔn)值的建立提供科學(xué)依據(jù). 目前，為建立我國土壤Cu的生態(tài)基準(zhǔn)值，學(xué)者們[1,3,7]已經(jīng)廣泛開展了關(guān)于我國土壤中Cu對植物(西紅柿、白菜、小麥、油菜等)、無脊椎動物(赤子愛勝蚓)和微生物(發(fā)光細(xì)菌和硝化細(xì)菌等)毒性閾值的研究，積累了大量Cu的毒理數(shù)據(jù). 但國內(nèi)有關(guān)Cu對白符跳毒性閾值的研究非常缺乏，并且已有研究多采用單一類型的土壤，沒有考慮土壤理化性質(zhì)的影響[8]. 眾所周知，自然界土壤類型復(fù)雜多樣，土壤理化性質(zhì)(pH、有機(jī)質(zhì)、土壤質(zhì)地、陽離子交換量和鐵錳鋁氧化物等)是影響重金屬毒性閾值的關(guān)鍵因子[1,9]，研究不同類型土壤中重金屬毒性閾值差異并基于土壤理化性質(zhì)特征建立重金屬毒性閾值的預(yù)測模型是科學(xué)建立土壤重金屬生態(tài)基準(zhǔn)值的關(guān)鍵[1]. 雖然國外學(xué)者已經(jīng)開展了較多的關(guān)于Cu對土壤白符跳毒性閾值的研究[10-13]，但研究[2,14-15]表明，由于土壤理化性質(zhì)的巨大差異(如土壤有機(jī)質(zhì)含量和礦物類型等)，導(dǎo)致基于國外土壤開展毒性試驗(yàn)獲得的毒性閾值數(shù)據(jù)和預(yù)測模型無法直接應(yīng)用到我國.

該研究以白符跳為受試生物，參照ISO標(biāo)準(zhǔn)方法指南[6]，以個(gè)體水平的死亡率和繁殖率為試驗(yàn)終點(diǎn)，選取我國9種有代表性的理化性質(zhì)差異明顯的土壤作為供試土壤，研究土壤外源添加Cu對白符跳的毒性閾值并建立毒性的預(yù)測模型，以期為我國土壤Cu生態(tài)基準(zhǔn)和環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂完善提供依據(jù)和參考.

1 材料與方法

1.1 供試土壤

選取并采集9種理化性質(zhì)各異的0～20 cm表層農(nóng)田土壤作為供試土壤：江西紅壤、安徽黃棕壤、重慶紫色土、云南黃紅壤、湖南水稻土、山東潮土、黑龍江黑土、新疆灰漠土、陜西壚土. 采集的土壤經(jīng)室內(nèi)自然風(fēng)干、剔除植物根系及石塊后，過2 mm篩，進(jìn)行土壤農(nóng)化分析[16-17]：采用pH計(jì)測定土壤pH(土水比為1∶2.5)；采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定土壤中w(OM)；采用EDTA-銨鹽快速法測定陽離子交換量(CEC)；采用中和滴定法測定w(CaCO3)；采用吸管法測定土壤中w(黏粒)；經(jīng)濕式消解法(HCl-HNO3-HF-H2O2)前處理后，測定w(TFe)(TFe為總Fe)、w(TMn)(TMn為總Mn)、w(TAl)(TAl為總Al)和w(CuBT)(CuBT為背景總Cu)；采用草酸-草酸銨浸提-鄰菲羅林比色法測定土壤中w(FeOX)(FeOX為非晶質(zhì)氧化鐵)、w(MnOX) (MnOX為非晶質(zhì)氧化錳)和w(AlOX)(AlOX為非晶質(zhì)氧化鋁).

1.2 供試白符跳

白符跳由中國科學(xué)院南京土壤研究所提供，已在筆者所在課題組實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)馴化超過3 a.

參照ISO標(biāo)準(zhǔn)指南[6]，白符跳飼養(yǎng)在培養(yǎng)皿(90 mm×13 mm)中，其底部鋪有約0.5 cm厚的培養(yǎng)基(活性炭與熟石膏質(zhì)量比為1∶9，加去離子水?dāng)嚢杈鶆虼淠坛尚?，放? d后使用). 利用安琪干酵母作為白符跳的食物，使用人工氣候箱控制飼養(yǎng)溫度為(20±1)℃，光照與黑暗比為16 h∶8 h(光照強(qiáng)度為400～800 lx)，空氣濕度為75%. 每隔1周打開蓋子補(bǔ)足空氣，必要時(shí)為培養(yǎng)基補(bǔ)充適量去離子水和適量食物. 飼養(yǎng)期間每隔兩個(gè)月更換一次培養(yǎng)基，而且要及時(shí)清除培養(yǎng)基表面的發(fā)霉食物殘?jiān)退劳龅陌追w，保持培養(yǎng)基表面清潔濕潤.

為降低不同白符跳蟲齡和個(gè)體大小差異對試驗(yàn)的影響，試驗(yàn)前白符跳需進(jìn)行同齡化培養(yǎng). 參照ISO標(biāo)準(zhǔn)指南[6]，將培養(yǎng)皿中的白符跳成蟲移入新制備的培養(yǎng)皿中，加入少量(約5 mg)干酵母，在人工氣候箱中培養(yǎng)，待白符跳在培養(yǎng)基表面產(chǎn)卵并孵化出幼蟲后，移走成蟲，3 d后將幼蟲轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)7～9 d，得到可用于正式毒理試驗(yàn)的10～12 d大小的白符跳. 同齡化期間培養(yǎng)條件與飼養(yǎng)條件相同.

1.3 土壤外源Cu添加

土壤中外源Cu以二水合氯化Cu(CuCl2·2H2O，優(yōu)級純)水溶液的方式添加，以只添加去離子水的土壤為對照組. 根據(jù)pH和w(OM)的差異設(shè)置濃度組，每個(gè)濃度組用土200 g. 江西紅壤、安徽黃棕壤、重慶紫色土、云南黃紅壤中添加的w(TCu)(TCu為土壤總Cu)分別為50、100、200、400和800 mgkg，湖南水稻土、山東潮土、黑龍江黑土、新疆灰漠土和陜西壚土中分別為100、200、400、800和 1 600 mgkg. 將土壤充分?jǐn)嚢杈鶆颍匀ルx子水將土壤水分調(diào)整到最大可持水量的55%～60%. 將制備的土壤盛于開口的自封袋中，在溫室內(nèi)進(jìn)行為期3周的老化(25 ℃，黑暗條件)，期間通過稱重法每隔3 d補(bǔ)充去離子水以維持土壤濕度.

1.4 白符跳毒性試驗(yàn)

稱取30 g老化后的濕土置于100 mL的有機(jī)玻璃杯中，加入10只10～12 d大小的白符跳和2 mg干酵母，蓋上蓋子放在人工氣候箱中培養(yǎng)28 d，培養(yǎng)條件與白符跳飼養(yǎng)條件相同. 試驗(yàn)期間，從第2周起每周添加1次2 mg干酵母(開蓋添加食物的過程中玻璃杯中的空氣也得到更新)，并通過稱重法補(bǔ)充少量去離子水. 試驗(yàn)結(jié)束后，將玻璃杯中的土倒入200 mL的燒杯，加入150 mL自來水和幾滴英雄牌藍(lán)色墨水，用玻璃棒輕輕攪動土壤，待存活的白符跳成蟲和繁殖的幼蟲浮到水面后用相機(jī)拍照，然后利用Image J軟件[18]中的細(xì)胞計(jì)數(shù)功能對照片中的白符跳存活和繁殖數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù).

1.5 土壤中w(Cu)的測定

采取老化土樣，風(fēng)干后過0.25 mm篩備用.w(CuCa)(CuCa為CaCI2溶液提取的Cu)的分析測定：參考Bur等[19]的方法，稱取2 g過0.25 mm篩的土壤置于50 mL塑料離心管中，加入20 mL 0.01 molL的CaCI2溶液，水浴振蕩2 h (25 ℃，200 rmin)后，3 000 rmin下離心10 min. 將上清液用0.45 μm的醋酸纖維濾膜過濾后，用1%的稀硝酸稀釋，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS，Agilent7500，美國安捷倫科技有限公司)測定濾液中ρ(Cu).w(TCu)的測定：參考FAN等[17]的方法，稱取0.1 g土樣，加入HF-HClO4-HNO3(體積比為3∶1∶1)后進(jìn)行微波消解(180 ℃，45 min)，采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES，RIS Advantage，美國安捷倫科技有限公司)測定溶液中ρ(Cu)，該消解和測定過程使用國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW-07410)作為質(zhì)控.

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SigmaPlot 12.5軟件中的Logistic曲線方程[20]推導(dǎo)白符跳存活的半致死濃度(LC50)、白符跳繁殖的半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)和上述閾值的95%置信區(qū)間：

y=k[1+(xx0)s]

式中：y為白符跳幼蟲數(shù)量或成蟲數(shù)量，只；x為w(TCu)實(shí)測值或w(CuCa)，mg/kg；k為對照組中白符跳幼蟲數(shù)量或成蟲數(shù)量，只；s為斜率參數(shù)；x0為LC50或EC50值，mg/kg. 使用SPSS 22.0軟件，利用皮爾遜相關(guān)性分析確定土壤理化性質(zhì)與Cu毒性閾值間的關(guān)系，利用簡單和多元逐步回歸分析方法建立基于土壤理化性質(zhì)的Cu對白符跳毒性閾值的回歸方程(即預(yù)測模型)，利用單因素方差分析比較試驗(yàn)組和對照組間白符跳存活和繁殖的顯著性差異. 采用OriginPro 8.5和Excel 2013軟件進(jìn)行圖表制作.

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

9種受試土壤的理化性質(zhì)如表1所示. 由表1可見，9種土壤的w(CuBT)范圍為10.8～29.3 mgkg，參照GB 15618—2018《土壤環(huán)境質(zhì)量 農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)(試行)》[21]可知，9種受試土壤均未受Cu的污染；土壤pH變化范圍為4.91～8.25，w(OM)為8.04～54.71 gkg，CEC為5.4～33.4 cmolkg；w(黏粒)為5.3%～38.6%；w(FeOX)、w(MnOX)和w(AlOX)也有較大差異.

2.2 不同土壤中Cu對白符跳毒性效應(yīng)和閾值的比較

28 d暴露試驗(yàn)后，各對照組土壤中成蟲存活率均高于80%，繁殖的幼蟲數(shù)均高于100只且不同重復(fù)間變異系數(shù)均低于35%，符合ISO標(biāo)準(zhǔn)指南[6]中關(guān)于試驗(yàn)有效性的標(biāo)準(zhǔn). 僅當(dāng)土壤外源添加的w(TCu)達(dá)到最高時(shí)，江西紅壤和安徽黃棕壤中白符跳存活數(shù)較對照組顯著降低(P<0.05)，但存活率依然高于50%，其他7種土壤中白符跳成蟲存活數(shù)均未出現(xiàn)隨w(TCu)的升高而明顯減少的現(xiàn)象(P>0.05，數(shù)據(jù)未展示)，因此無法計(jì)算Cu對白符跳存活的LC50值. 由圖1可見，整體而言，不同土壤中白符跳繁殖的幼蟲數(shù)量與外源添加的w(TCu)之間的劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯，但變化趨勢不同. 如當(dāng)土壤中w(TCu)為200 mg/kg 時(shí)，陜西壚土和新疆灰漠土中白符跳繁殖率與

表1 9種受試土壤的理化性質(zhì)

注：數(shù)據(jù)以平均值±相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示(n=3).

圖1 暴露28 d后不同土壤中Cu對白符跳繁殖毒性效應(yīng)的差異Fig.1 The reproduction toxicity effects of Cu on Folsomia candida in different soils after 28 days of exposure

對照組相比未受明顯影響(P>0.05)，其余土壤中白符跳繁殖率顯著降低(P<0.05)，并且在安徽黃棕壤和江西紅壤中甚至已幾乎觀察不到幼蟲. 基于w(TCu)實(shí)測值推導(dǎo)的Cu對白符跳繁殖的EC50值的變化范圍為65～668 mg/kg(見表2)，最大值是最小值的10.3倍.

2.3 基于土壤理化性質(zhì)的Cu對白符跳繁殖的EC50的預(yù)測模型

利用皮爾遜相關(guān)分析，將基于w(TCu)實(shí)測值推導(dǎo)的Cu對白符跳繁殖的EC50值與土壤理化性質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，EC50值與土壤pH、w(CaCO3)均呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.801(P<0.01)和0.670(P<0.05). EC50值與其他理化性質(zhì)間的相關(guān)性均未達(dá)到顯著水平. 進(jìn)一步利用回歸分析建立回歸方程

表2 基于w(TCu)實(shí)測值和w(CuCa)推導(dǎo)的Cu對白符跳繁殖的EC50值

注：括號內(nèi)數(shù)值為毒性閾值的95%置信區(qū)間.

(即毒性預(yù)測模型)(見表3)，發(fā)現(xiàn)土壤pH是影響Cu對白符跳繁殖的EC50的最重要的單一因子，解釋了不同土壤之間EC50值58.0%的差異. 進(jìn)一步引入w(OM)因子后，預(yù)測模型的決定系數(shù)顯著提高，pH和w(OM)可解釋EC50值92.7%的差異. 由圖2可見，基于w(TCu)實(shí)測值推導(dǎo)的Cu的EC50值與基于pH、w(OM)建立的模型預(yù)測的EC50值之間相關(guān)性很好(R2=0.93).

表3 基于土壤理化性質(zhì)建立的Cu對白符跳繁殖的EC50的預(yù)測模型

注： 所用模型為lg(EC50)=0.213+0.288pH+0.016w(OM).圖2 基于w(TCu)實(shí)測值推導(dǎo)的Cu對白符跳繁殖的EC50值與利用模型預(yù)測的EC50值間的相關(guān)關(guān)系Fig.2 The correlation relationship between calculated EC50 values based on measured total Cu and predicted EC50 for the reproduction of Folsomia candida

3 討論

污染物對生態(tài)受體的毒性閾值大小與選取的評價(jià)終點(diǎn)有關(guān)[9,22]. 存活率和繁殖率是白符跳毒性閾值研究中最常用的評價(jià)指標(biāo)[5-6]. 該研究表明，土壤Cu對白符跳繁殖率的影響遠(yuǎn)高于存活率，在所有受試土壤中白符跳的存活率與w(TCu)之間沒有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，與之前有關(guān)土壤Cu對白符跳毒性閾值的研究發(fā)現(xiàn)一致[11,13]. 這可能與白符跳遇到脅迫時(shí)往往會通過放棄生殖繁衍來優(yōu)先適應(yīng)環(huán)境，維持自身存活的生理特征有關(guān)[23-24]. 此外也有研究[25]認(rèn)為，白符跳在土壤中產(chǎn)卵后，無法移動的蟲卵與金屬污染物充分接觸，更容易受到金屬毒性脅迫. 因此，該研究主要針對我國典型土壤的理化性質(zhì)與Cu對白符跳繁殖的EC50值之間的關(guān)系進(jìn)行討論.

土壤理化性質(zhì)影響重金屬的生物有效性，進(jìn)而影響其在土壤固相與液相之間的分配比、移動性、和毒性[9-10]. 研究不同類型土壤中重金屬的毒性閾值差異，對于土壤生態(tài)基準(zhǔn)的建立和場地的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)都具有重要意義[1,26]. 已有許多研究報(bào)道了我國不同土壤中Cu毒性閾值的差異和土壤理化性質(zhì)對Cu毒性閾值的影響[1,7]，與此類似，筆者發(fā)現(xiàn)，不同土壤中Cu對白符跳繁殖的EC50值的差異明顯. 由于通過皮膚接觸和吸收土壤溶液中的重金屬是白符跳非常重要的暴露途徑[27-28]，因此Cu對白符跳繁殖的EC50值的差異與不同土壤中w(CuCa)(常用來表征土壤金屬生物有效態(tài)濃度)有關(guān)(見圖3). 如該研究發(fā)現(xiàn)，陜西壚土中Cu毒性最小〔土壤中w(CuCa)最低〕，而江西紅壤中Cu毒性最大〔土壤中w(CuCa)最高〕(見圖3)；進(jìn)一步基于w(CuCa)推導(dǎo)Cu對白符跳繁殖的EC50值后發(fā)現(xiàn)，不同土壤中Cu的EC50最大值與最小值之比由10.3降至8.8(見表2)，表明氯化鈣提取態(tài)Cu可在一定程度上預(yù)測和解釋不同土壤中Cu對白符跳繁殖的EC50值的差異. 雖然已有研究鮮見報(bào)道基于w(CuCa)推導(dǎo)的Cu對白符跳繁殖的EC50值，但有關(guān)鋅對白符跳毒性閾值的研究[28-29]得到了與筆者類似的結(jié)論.

圖3 不同土壤中測定的w(CuCa)與添加的w(TCu)的關(guān)系Fig.3 Relationship between measured CaCl2-extracted Cu and added total Cu concentrations in different soils

目前，國外已經(jīng)建立了Cu、Zn和Cd對白符跳毒性閾值的預(yù)測模型[10,28,30]. 筆者在該研究中建立了基于我國土壤理化性質(zhì)的Cu對白符跳繁殖的EC50值的預(yù)測模型，結(jié)果表明，pH和w(OM)可較好地解釋不同土壤中Cu的EC50值的差異，其中pH是預(yù)測我國典型土壤中Cu的EC50值的最重要的單一因子，可解釋不同土壤中EC50值58.0%的差異. 基于其他土壤理化性質(zhì)建立的模型的P值均大于0.05，說明這些理化性質(zhì)對土壤銅毒性的貢獻(xiàn)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均不顯著. Criel等[10]研究也發(fā)現(xiàn)，pH和w(OM)可較好地解釋國外不同土壤中Cu對白符跳繁殖毒性的差異. 事實(shí)上，許多研究表明，pH和w(OM)也是影響和預(yù)測Cu對其他物種毒性閾值的關(guān)鍵因素. 如LI等[14]發(fā)現(xiàn)，pH和w(OM)可較好地解釋不同土壤中Cu對大麥根伸長的毒性閾值的差異. 這是因?yàn)镃u在土壤溶液中以陽離子形態(tài)存在，pH較低時(shí)，帶有可變電荷的土壤表面正電荷數(shù)隨之增加，這會與Cu2+競爭吸附點(diǎn)位，造成土壤對Cu的吸附強(qiáng)度和能力減弱[14,31-32]，從而導(dǎo)致土壤溶液中Cu2+的濃度較高，容易進(jìn)入生物體內(nèi)對其產(chǎn)生毒性效應(yīng). 此外，研究表明，Cu在含有較高w(CaCO3)的堿性土壤中會形成Cu2(OH)2CO3沉淀[32]，降低土壤溶液中Cu2+濃度，這也能解釋堿性土壤中Cu對白符跳較低的毒性，同時(shí)也是w(CaCO3)與Cu的EC50值間呈顯著正相關(guān)的重要原因. 此外，土壤有機(jī)質(zhì)作為一種高分子化合物，本身存在大量的含氧活性功能團(tuán)(如羧基、酚羥基和醇羥基等)，可以通過金屬橋接作用與Cu形成絡(luò)合物[1,33]，從而促進(jìn)土壤對Cu的吸附，降低土壤溶液中Cu2+的濃度，減輕Cu對生物的毒性效應(yīng).

理論上，建立土壤重金屬生態(tài)基準(zhǔn)旨在保護(hù)包括植物、無脊椎動物和微生物在內(nèi)的不同土壤生態(tài)受體，當(dāng)前國內(nèi)學(xué)者雖然已經(jīng)建立了我國土壤中Cu的生態(tài)基準(zhǔn)，但主要是基于Cu對不同植物的毒性閾值[34-35]. 因此，該研究獲得的我國典型土壤中Cu對無脊椎動物白符跳的毒性閾值和基于理化性質(zhì)建立的毒性閾值的預(yù)測模型將有助于后續(xù)我國土壤Cu生態(tài)基準(zhǔn)值的提高與完善.

4 結(jié)論

a) 白符跳的繁殖率對土壤Cu毒性響應(yīng)較存活率更為敏感.

b) 9種土壤中Cu對白符跳繁殖的EC50的差異明顯，最高值是最低值的10.3倍，土壤中氯化鈣提取態(tài)Cu可在一定程度上解釋上述差異.

c) 土壤pH是影響不同土壤中Cu對白符跳EC50的最重要的單一因子，可解釋不同土壤中EC50值58.0%的差異，且與w(OM)結(jié)合后能夠更好地預(yù)測土壤Cu的EC50值.

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