楊亞楠，于時卉，閆香珍，羅禮君

牙周優(yōu)勢致病菌如牙齦卟啉單胞菌(porphyromonasgingivalis,Pg)入侵組織后引發(fā)的一系列炎癥反應(yīng)和巨噬細胞極化在牙周炎發(fā)病過程中至關(guān)重要。巨噬細胞在牙周組織中廣泛存在，可以通過識別清除病原體、殺傷靶細胞、抗原提呈、免疫調(diào)節(jié)等功能維持機體的穩(wěn)態(tài)。巨噬細胞主要有兩種不同的激活狀態(tài)：經(jīng)典活化型巨噬細胞(classically activated macrophages, CAMs)，即M1型；選擇性活化型巨噬細胞(alternatively activated macrophages, AAMs)，也稱M2型。在感染初期，巨噬細胞呈現(xiàn)促進炎癥反應(yīng)的M1表型，當直接危險因素去除后，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榈挚寡装Y的M2表型，以適應(yīng)機體對炎癥消除和損傷修復的需要。M1、M2激活失衡或表型轉(zhuǎn)換的時機錯亂都可能導致機體無法對感染和損傷做出合理的免疫反應(yīng)，促進牙周炎的發(fā)展和組織損傷的加重。

目前，超過90%的糖尿病(diabetes mellitus, DM)是以胰島細胞功能受損、胰島素抵抗為特征的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)。而巨噬細胞極化在胰島素抵抗中的作用尤其顯著[1-2]。在肥胖人群中，T2DM的發(fā)生往往以慢性炎癥為特征?，F(xiàn)有研究表明，被招募到脂肪組織的巨噬細胞表現(xiàn)為M1型激活，導致一系列細胞因子(包括TNF-α、IL-6、IL-1β)介導炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗[3-5]。另一方面M2型巨噬細胞不僅抑制炎癥細胞因子的表達，而且還通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)抑制脂肪前體細胞的增殖，從而維持胰島素的敏感性。目前, 許多研究已經(jīng)證實了糖尿病與牙周炎的雙向關(guān)系，二者疾病嚴重程度往往呈現(xiàn)相關(guān)性[6-9]，提示控制血糖、血脂代謝對伴T2DM 慢性牙周炎患者牙周治療效果意義重大。另一方面，牙周炎作為慢性炎癥對糖尿病的代謝控制具有負面影響，慢性牙周炎目前被公認是導致血糖控制不佳的危險因素之一。

本課題組前期研究證實在C57BL/6J野生型小鼠中，Pg感染巨噬細胞可引起其向M1極化，加重組織損傷，而誘導M1巨噬細胞去極化或促使其向M2極化轉(zhuǎn)變對減少損傷和促進組織修復具有重要意義[10]。本研究旨在初步探討Pg對db/db小鼠(2型糖尿病小鼠)骨髓來源巨噬細胞(bone marrow-derived macrophages, BMDMs)的極化作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器 C1000 TouchTMThermal Cycler PCR儀(Bio-rad，美國)，Lightcycler480型熒光定量PCR儀(Roche，美國)。

1.1.2 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone，美國)，胎牛血清(Gibco，美國)，青霉素鏈霉素溶液(Invitrogen, 美國)，Trizol(Life Technologies, 美國)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara, 日本)，SYBR Green qRT-PCR試劑盒(Toyobo，日本)，腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(康潤，中國)，無菌脫纖維羊血(康潤，中國)，厭氧袋(三菱，日本)，氯化血紅素(國藥，中國)，維生素K1注射液(阿拉丁，中國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠骨髓來源巨噬細胞獲取與培養(yǎng) 分別選取6～8周齡的C57BL/6J WT小鼠(來自南京生物醫(yī)藥研究院)和此來源的db/db小鼠，頸椎脫臼法處死，將小鼠浸泡于75%乙醇中30 s～1 min充分消毒，轉(zhuǎn)移至超凈臺中。無菌下分離股骨頭與髖骨，去除腿骨表面皮膚，將股骨與脛骨完整取出后置于PBS溶液中，剝除骨骼上附著的肌肉組織，分離股骨與脛骨。剪去骨骼兩端后，將裝有DMEM培養(yǎng)液1 mL無菌注射器針頭插入骨髓腔，將骨髓反復沖洗至15 mL離心管中，直至骨髓腔變白。室溫下，500g、10 min離心細胞后，棄上清，加入含20 ng/mL的M-CSF的DMEM培養(yǎng)液[11-13]，以1×106個/孔鋪于12孔板。在37 ℃、5% CO2條件下，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。

1.2.2 牙齦卟啉單胞菌培養(yǎng) 無菌條件下，將PgATCC33277(上海交通大學醫(yī)學院口腔醫(yī)學研究所李鳴宇教授饋贈)溶于80～100 μL的羊血后均勻涂布于血平板上，置于厭氧罐內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)。4～5 d后，血平板上見黑色光亮、圓形的單個菌落，用無菌接種環(huán)挑取單克隆至無菌腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中，在厭氧條件下培養(yǎng)24～48 h。通過菌落形態(tài)、革蘭陰性染色等方法鑒定Pg為純培養(yǎng)后，5 000 r/min、5 min離心，棄上清，PBS清洗3遍，液體培養(yǎng)基重懸。比濁儀檢測菌液在波長600 nm處吸光值約0.5時，Pg濃度約1×109個/mL。

1.2.3 qRT-PCR 法檢測db/db小鼠BMDMs中極化標志物基因表達情況 (1)將WT和db/db小鼠來源的BMDMs鋪板，設(shè)立空白對照組、Pg組、IL-4組和Pg+IL-4組，分別加入Pg(MOI=50)和/或IL-4(20 ng/mL)刺激后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。之后在4、16 h時收樣，-20 ℃保存。(2)采用Trizol提取總RNA，紫外分光光度計測定濃度與純度并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用基因特異性引物和SYBR Green qRT-PCR試劑盒進行實驗。引物見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 Pg對db/db小鼠BMDMs向M2極化的抑制作用減弱

糖尿病是牙周炎的高危因素，為了探討糖尿病對Pg誘導下的巨噬細胞M1極化的影響，我們從db/db小鼠中分離出BMDMs進行實驗。檢測在Pg或/和IL-4的刺激下，db/db小鼠BMDMs中M1標志物Tnf-α、Il-12以及M2標志物Arg1、Ym1、Fizz1和Mrc1的基因相對表達量。

實驗結(jié)果表明，WT小鼠的BMDMs在IL-4以及IL-4+Pg誘導下，M2極化標志基因Arg1、Fizz1和Mrc1的表達顯著降低；而db/db小鼠BMDMs在IL-4誘導下，有無Pg感染，上述基因的表達水平無統(tǒng)計學差異(圖1A，1B，1C)，Ym1的表達明顯下降(圖1D)，表明糖尿病能夠部分削弱Pg對巨噬細胞向M2極化的抑制作用。

Arg1(A)、Fizz1(B)、Mrc1(C)和Ym1(D)mRNA的相對表達量。*:P< 0.05, **：P<0.01, N.S.指無統(tǒng)計學差異

圖1Pg對IL-4誘導下的BMDMs表達M2標志基因的影響

Fig.1Effects ofPgon expression of M2markergenes of IL-4induced BMDMs

2.2 Pg促進db/db小鼠BMDMs向M1極化的作用減弱

實驗同上，WT組，Pg上調(diào)M1極化標志基因Tnf-α的表達，且在IL-4的同時作用下，M1基因表達無明顯下降；然而，db/db組Pg與IL-4協(xié)同刺激時，Tnf-α的表達量明顯下調(diào)(圖2A)。相較于WT小鼠，db/db小鼠Pg誘導BMDMs表達M1標志物Il-12的能力顯著下調(diào)(圖2B)。結(jié)果顯示Pg促進db/db小鼠BMDMs向M1極化的作用減弱。綜上所述，Pg對同種極化類型的BMDMs標志基因的影響并不是完全一致的，但在db/db小鼠中，巨噬細胞向M1極化整體呈現(xiàn)衰減的趨勢。

Tnf-α(A)和Il-12(B)mRNA的相對表達量。*：P< 0.05, ** ：P<0.01, N.S.指無統(tǒng)計學差異

圖2Pg對IL-4誘導下的BMDMs表達M1標志基因的影響

Fig.2Effects ofPgon expression of M1marker genesof IL-4induced BMDMs

3 討 論

兩種不同激活狀態(tài)的巨噬細胞分別對應(yīng)不同的病原刺激物，細菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和受損組織釋放的損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMP)等病原成分刺激巨噬細胞發(fā)生經(jīng)典激活，合成并釋放大量的炎癥性細胞因子，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細胞介素-1(interleukin-1, IL-1)、IL-6和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)等，參與細胞內(nèi)病原體的清除和牙周組織的損傷及破壞[14]；而IL-4和IL-13誘導巨噬細胞發(fā)生選擇性激活，激活后的M2型巨噬細胞表達抵抗素樣分子-α(resistin-like-α, RELMα/Fizz1)、殼多糖酶3樣蛋白-3(chitinase 3-like 3, CHI3L3/Ym1)、精氨酸酶-1(arginase 1, Arg1)、甘露糖受體C-1(mannose receptor C-Type 1, Mrc1)和IL-10等分子，抑制寄生蟲感染和炎癥反應(yīng)，促進損傷的修復和組織重建[15]。我們前期研究表明Pg通過抑制αKG代謝通路中相關(guān)基因的表達，誘導巨噬細胞向M1極化[10]。本研究結(jié)果顯示，在糖尿病小鼠來源的同種極化類型的骨髓巨噬細胞中，M1和M2標志基因的表達趨勢并不是完全一致的，Pg對M1極化的促進功能和IL-4對M2極化的誘導作用都遭到了一定程度的削弱，

db/db小鼠指瘦素受體突變的小鼠，這種基因敲除小鼠提供了一種單基因T2DM動物模型，具有肥胖和早期胰島素抵抗的特征[16-17]。瘦素調(diào)節(jié)多種免疫和炎癥過程[18-19]，炎癥刺激如TNF-α, IL-1或LPS刺激脂肪組織表達瘦素，反過來，瘦素促進細胞增殖、生存、遷移、趨化作用，細胞因子、蛋白酶和粘附分子的表達以及氧化應(yīng)激。因此，瘦素受體的突變可能影響炎癥因子的表達。5～28周齡的db/db小鼠不僅有典型糖尿病臨床表現(xiàn),也表現(xiàn)出心肌病、周圍神經(jīng)病變、糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、傷口愈合遲滯等糖尿病的并發(fā)癥[20]，這些疾病的常見表現(xiàn)是過度纖維化和組織重構(gòu)，通常與M2巨噬細胞有關(guān)，而非炎性M1巨噬細胞，所以db/db小鼠中M2巨噬細胞的表達可能是增加的[21]。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病的發(fā)展與db/db小鼠胃黏膜組織中巨噬細胞數(shù)量的增加和這些巨噬細胞中血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)的上調(diào)有關(guān)，這些巨噬細胞呈CD206陽性即M2巨噬細胞[22]。

瘦素信號在維持吞噬功能中似乎是必需的，具有促進單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)的能力[23]。有研究提出假設(shè)，肥大細胞(MCs)產(chǎn)生的IFN-γ和IL-6可能導致ob/ob 小鼠(即瘦素基因突變小鼠)來源的BMDMs減少向M1極化，來自ob/ob 骨髓肥大細胞的IFN-γ，IL-6和IL-13和其他未經(jīng)檢測的介質(zhì)可能有助于增強巨噬細胞IL-4表達和M2巨噬細胞極化[24]。MCs與BMDMs體外共培養(yǎng)后，IL-4刺激后精氨酸酶-1和IL-10表達增加，但是抑制了脂多糖(LPS)刺激后誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和IL-6的表達[24]。而ob/ob和db/db小鼠均是理想的2型糖尿病動物模型，由此我們推測db/db小鼠骨髓中的肥大細胞產(chǎn)生的細胞因子，可能促使BMDMs在Pg作用下仍高表達部分M2標志基因。

綜上所述，Pg對db/db小鼠的BMDMSs向M1極化的促進作用減弱可能是由于在瘦素受體突變下IL-4誘導M2型的作用更敏感。但是Pg對糖尿病小鼠巨噬細胞極化機制的影響尚需深入研究。