畢翔宇，孫 安，何惠宇

面對(duì)腫瘤、頜骨囊腫及外傷等造成的大范圍骨組織缺損，自體骨移植由于骨量不足不能完成對(duì)大塊組織缺損的修復(fù)[1]。目前人工合成的組織工程骨雖然不受骨量不足的限制，但許多研究均發(fā)現(xiàn)由于缺乏有效的血液供應(yīng)，來(lái)自組織液的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)只能滿足人工骨支架外層100～200 μm范圍內(nèi)的細(xì)胞代謝，而位于支架中心部位的細(xì)胞則由于缺乏氧氣和營(yíng)養(yǎng)供給出現(xiàn)壞死，不能形成新骨[2-3]。近年來(lái)血管化在組織工程研究中的地位逐漸上升，血管化的組織工程骨能夠?yàn)槿睋p區(qū)帶來(lái)充足的氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、干細(xì)胞和相關(guān)信號(hào)分子[3]。因此，利用血管化的方法使移植部位形成新生血管并長(zhǎng)入人工骨支架內(nèi)部，使支架表層及內(nèi)部均能獲得充足的血液供給，從而提高組織工程骨的成活率，將有助于大范圍骨缺損的修復(fù)。

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是生理性血管生成過(guò)程中重要的調(diào)控因子[3]，在血管生成早期即可發(fā)揮作用并持續(xù)到血管生成的各個(gè)時(shí)期[4]，能夠提高組織的血流量[5]。VEGF能與內(nèi)皮細(xì)胞的表面受體特異性結(jié)合，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖并聚集形成血管管腔結(jié)構(gòu)[3-4]。在血管形成過(guò)程中血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor, PDGF)與血管平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞表面的受體結(jié)合能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞聚集并包裹血管內(nèi)皮細(xì)胞，維持血管結(jié)構(gòu)的完整和穩(wěn)定[3]，敲除PDGF及其受體的基因會(huì)導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞的缺失[5-7]。因此聯(lián)合應(yīng)用VEGF與PDGF將有望促進(jìn)新血管的形成，同時(shí)有利于形成完整而穩(wěn)定的血管。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow steam cell,BMSCs)是組織工程研究中常用的種子細(xì)胞，具有多向分化潛能，能夠向骨、軟骨、神經(jīng)、脂肪及血管等方向分化[8]。由日本學(xué)者Elloumi-Hannachi等[9]發(fā)明的細(xì)胞膜片技術(shù)無(wú)需胰酶消化，完整地保留了細(xì)胞間連接及細(xì)胞自身分泌的細(xì)胞間基質(zhì)。細(xì)胞間連接的保留有利于細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞的增殖和分化。細(xì)胞間基質(zhì)能儲(chǔ)存生長(zhǎng)因子并緩慢釋放到周圍環(huán)境當(dāng)中，對(duì)生長(zhǎng)因子起到了一定程度的緩釋作用。因此本實(shí)驗(yàn)以細(xì)胞膜片作為VEGF與PDGF的載體來(lái)研究其對(duì)血管化的作用。

本課題組前期體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)VEGF-165和PDGF-BB兩種細(xì)胞因子促進(jìn)骨髓干細(xì)胞增殖及成血管分化的最佳濃度均為80 ng/mL。本實(shí)驗(yàn)以此為前提聯(lián)合應(yīng)用VEGF-165及PDGF-BB兩種生長(zhǎng)因子作用于大鼠骨髓干細(xì)胞膜片并植入大鼠體內(nèi)，通過(guò)比較單獨(dú)與聯(lián)合應(yīng)用VEGF-165與PDGF-BB對(duì)成血管相關(guān)基因表達(dá)及新生血管數(shù)量、管腔面積和管腔形態(tài)的影響來(lái)驗(yàn)證聯(lián)合VEGF-165與PDGF-BB對(duì)血管生成是否具有協(xié)同作用，為其在骨組織工程血管化的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

250～300 g SD雄性大鼠及40～50 g SD大鼠，雌雄不限，均購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室與動(dòng)物管理處動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。α-MEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó))，L谷氨酰胺(Hyclone，美國(guó))，胎牛血清(四季青，中國(guó))，RT-PCR儀(BIO-RAD，美國(guó))，PCR Kit(QIAGEN，德國(guó))，顯微鏡、切片機(jī)、脫水機(jī)、包埋機(jī)(徠卡，德國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 40～50 g SD大鼠作為骨髓干細(xì)胞供體，250～300 g SD大鼠用于構(gòu)建動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(僅加入細(xì)胞膜片不加入生長(zhǎng)因子)、單純VEGF組(V組)、單純PDGF組(P組)和VEGF+PDGF組(V+P組)。分別于2周和4周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)回收標(biāo)本。

1.2.2 大鼠骨髓干細(xì)胞的分離培養(yǎng) 將4周齡SD大鼠脫頸處死，浸泡于75%乙醇中消毒5 min。用眼科剪分離四肢及皮膚。用手術(shù)刀片分離肌肉，僅保留四肢長(zhǎng)骨。將取下的長(zhǎng)骨浸泡于裝有PBS溶液的15 mL離心管中，并暫時(shí)于冰盒中存放。將取下的四肢長(zhǎng)骨在無(wú)菌操作臺(tái)下用眼科剪剪斷長(zhǎng)骨的干骺端，然后用注射器反復(fù)沖洗骨髓直至骨組織表面發(fā)白。將所得細(xì)胞懸液在1 000 r/min條件下離心5 min，棄上清，用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基重懸沉淀。將細(xì)胞懸液接種到25 cm2的培養(yǎng)皿中。每3天換一次液，細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí)傳代。

1.2.3 細(xì)胞膜片的構(gòu)建 將第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以3×105/孔接種到六孔板中，加入含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基。待細(xì)胞長(zhǎng)滿100%時(shí)更換含10%胎牛血清、1%青鏈霉素和50 μg/mL抗壞血酸的α-MEM培養(yǎng)基，每2天換一次液連續(xù)培養(yǎng)6 d，第7天時(shí)更換不含抗生素的培養(yǎng)基直至成膜。

1.2.4 構(gòu)建動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?根據(jù)本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)的80 ng/mL VEGF-165 和80 ng/mL PDGF-BB為促骨髓干細(xì)胞成血管分化的最佳濃度。將生長(zhǎng)因子以該最適濃度加入細(xì)胞膜片培養(yǎng)24 h以備回植。用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g腹腔注射對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉。麻醉后于腹部正中做一2 cm切口，鈍性分離皮下組織形成一盲袋以供細(xì)胞膜片植入。實(shí)驗(yàn)組分別植入含有80 ng/mL VEGF-165、80 ng/mL PDGF-BB和同時(shí)含80 ng/mL VEGF-165和80 ng/mL PDGF-BB的細(xì)胞膜片。對(duì)照組僅回植膜片。膜片植入后用3-0縫線縫合皮膚，見圖1。

A：膜片植入前于六孔板中；B：膜片植入后縫合創(chuàng)口；C：體內(nèi)標(biāo)本；D：標(biāo)本取出后

圖1膜片植入前及標(biāo)本取出后圖片

Fig.1Cell sheet and tissue sample

1.2.5 蘇木素-伊紅染色 分別于造膜后2周和4周取出標(biāo)本，見圖1，分別經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h后梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚度切片。將切片置于60 ℃過(guò)夜后行蘇木素-伊紅染色。最后中性樹膠封片，顯微鏡下放大100倍拍照。

1.2.6 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及RT-PCR 將回收的組織塊于液氮中速凍后用研磨儀研磨成碎絮狀。研磨后的組織用Trizol法提取總RNA，使用takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用RT-PCR法檢測(cè)成血管相關(guān)因子低氧誘導(dǎo)因子-1-α(hypoxia inducible factor-1，HIF-1-α)、血管生成素-1(angiopoietin-1，Ang-1)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)、類胰島素生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)的基因表達(dá)，此過(guò)程重復(fù)3次。利用NCBI查找目的基因，通過(guò)Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物序列見表1。

1.2.7 新生血管測(cè)量 從每組中隨機(jī)選取5～8張切片，將切片在光鏡下放大100倍拍照，根據(jù)完整的內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)確定血管的范圍，利用Image Pro軟件對(duì)每張切片中的所有血管的管腔面積進(jìn)行測(cè)量，同時(shí)統(tǒng)計(jì)出每張照片的血管數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1目的基因的引物序列

Tab.1Primer of target genes

基因引物序列HIF-1-α5′-CCGCCACCACCACTGATGAATC-3′(F)5′-CCGACTGTGAGTACCACTGTATGC-3′(R)Ang-15′-TTCTTCGCTGCCATTCTGACTCAC-3′(F)5′-GTTGTACTGCTCTGTCGCACTCTC-3′(R)HGF5′-CAGTCAGCACCATCAAGGCAAGG-3′(F)5′-CCACGACCAGGAACAATGACACC-3′(R)IGF-15′-CTGGTGGACGCTCTTCAGTTCG-3′(F)5′-ACAGTACATCTCCAGCCTCCTCAG-3′(R)

2 結(jié) 果

2.1 成血管相關(guān)因子表達(dá)量

術(shù)后2周、4周各組Ang-1、HIF-1-α、HGF和IGF-1基因的表達(dá)見表2。術(shù)后2周及4周V+P組的基因表達(dá)量最高，其次為P組，對(duì)照組表達(dá)量最低，4組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組的基因相對(duì)表達(dá)量見表 2。

表2 術(shù)后2周、4周成血管因子表達(dá)量

2.2 血管數(shù)量、面積計(jì)算結(jié)果

術(shù)后2周和4周(表3)可見V組血管的管腔面積明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。P組和V+P組的管腔面積與對(duì)照組相比差異不大。術(shù)后2周和4周均可見V+P組血管數(shù)量高于另外三組，約為另外三組的2～3倍(P<0.05)。2周和4周相比，4周各組血管數(shù)量均高于2周(P<0.05)。

2.3 HE染色結(jié)果

鏡下(圖2)可見V組血管管腔形態(tài)不規(guī)則，管腔面積與對(duì)照組相比擴(kuò)張明顯。V+P組血管管腔形態(tài)及面積與對(duì)照組相似。P組管腔面積與對(duì)照組相似，但管腔形態(tài)不同于對(duì)照組的卵圓形結(jié)構(gòu)。

表3 術(shù)后2周、4周各組血管面積及數(shù)量

A：術(shù)后2周V組；B：術(shù)后2周P組；C：術(shù)后2周V+P組；D：術(shù)后2周對(duì)照組；E：術(shù)后4周V組；F：術(shù)后4周P組；G：術(shù)后4周V+P組；H：術(shù)后4周對(duì)照組

圖2術(shù)后2周和4周HE染色結(jié)果

Fig.2HE staining2and4weeks after graft

2.4 細(xì)胞膜片大體形態(tài)

BNSCs接種于六孔板后連續(xù)培養(yǎng)14～20 d可見培養(yǎng)皿底部有白色半透明膜樣物質(zhì)即為所形成的膜片。部分培養(yǎng)皿中可見膜片邊緣卷起，與培養(yǎng)皿透明底部形成對(duì)比。膜片可以用鑷子提起，有一定張力，完全提起后膜片聚縮成一團(tuán)(圖3)。

A：用鑷子提起膜片；B：用鑷子提起后膜片縮聚成一團(tuán)；C：去掉培養(yǎng)基后可見膜片呈乳白色半透明狀；D：膜片附著在培養(yǎng)皿底部部分邊緣卷起

圖3骨髓干細(xì)胞膜片

Fig.3Bone marrow steam cell sheet

3 討 論

血管化作為組織工程骨移植的基礎(chǔ)，近年來(lái)與其相關(guān)的研究取得了突出進(jìn)展，其中生長(zhǎng)因子在血管化的過(guò)程中扮演著十分重要的角色。本實(shí)驗(yàn)以BMSCs為種子細(xì)胞研究血管化中最重要的生長(zhǎng)因子VEGF-165和PDGF-BB是否對(duì)血管化具有協(xié)同作用，并比較聯(lián)合兩種生長(zhǎng)因子與單獨(dú)使用一種生長(zhǎng)因子對(duì)成血管的影響。

VEGF是病理性及生理性血管形成中的重要生長(zhǎng)因子[10]。其受體包括VEGFR-1(flt1)、VEGFR-2(flk1)、VEGFR-3(flt4)，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)表面存在VEGFR-2。VEGF-165是VEGF家族促血管生成能力最強(qiáng)的生長(zhǎng)因子，與VEGFR-2結(jié)合后能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂，同時(shí)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞向受損的血管部位遷移并聚集形成血管管腔結(jié)構(gòu)[11-12]。但是血管的生成不僅依賴于血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和聚集，同時(shí)也需要周細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞從外側(cè)包裹血管內(nèi)皮細(xì)胞從而形成完整而穩(wěn)定的血管結(jié)構(gòu)[13]。PDGF是來(lái)源于血小板的一種雙鏈二聚體可溶性糖蛋白，其結(jié)構(gòu)包含5種同分異構(gòu)體分別是PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD和PDGF-AB，與其相對(duì)應(yīng)的受體有PDGFR-αα、PDGFR-ββ和PDGFR-αβ[14-15]。其中PDGF-BB可以與這3種受體結(jié)合，是PDGF家族中活性最強(qiáng)的細(xì)胞因子[16]。當(dāng)PDGF與其受體結(jié)合時(shí)會(huì)激活包括Ras-ERK、c-Src和Rap1-Rac在內(nèi)的信號(hào)通路[17]。通過(guò)激活上述信號(hào)通路，PDGF能夠使血管平滑肌細(xì)胞與周細(xì)胞增殖并聚集到ECs周圍[18-19]。PDGF或PDGFR的基因敲除將導(dǎo)致新生成的ECs管腔由于缺乏周細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的覆蓋而不能形成完整的血管管腔結(jié)構(gòu)[20-21]。本實(shí)驗(yàn)中V組的血管管腔結(jié)構(gòu)較對(duì)照組擴(kuò)大明顯，且鏡下可見其外形不規(guī)則，而V+P組的管腔結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相似為卵圓形，且血管管腔面積也與對(duì)照組相似，推測(cè)由于PDGF的加入促進(jìn)了周細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的包裹，使新形成的血管具備完整的管腔結(jié)構(gòu)，而V組由于缺乏PDGF-BB同時(shí)VEGF-165不具備募集周細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的能力導(dǎo)致新生血管缺乏周細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞層，不能形成正常的血管。說(shuō)明VEGF-165與PDGF-BB聯(lián)合作用的成血管效果優(yōu)于單獨(dú)使用VEGF-165一種生長(zhǎng)因子。單位面積內(nèi)的血管數(shù)量能夠反映出組織的血供，血管數(shù)量越多說(shuō)明血供越好。本實(shí)驗(yàn)對(duì)血管數(shù)量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明術(shù)后2周、4周V+P組血管數(shù)量是其他三組的2～3倍，而V組和P組未表現(xiàn)出明顯的血管增多，說(shuō)明聯(lián)合使用VEGF-165與PDGF-BB能更加促進(jìn)新血管的形成，有利于提高組織的血液灌注。實(shí)驗(yàn)中隨著時(shí)間的推移，4周各組血管數(shù)量要高于2周，推測(cè)術(shù)后4周時(shí)血管的增長(zhǎng)并沒(méi)有達(dá)到平臺(tái)期，因此還需要長(zhǎng)期的效果觀察。

血管形成過(guò)程中除了有VEGF和PDGF發(fā)揮作用外還有包括Ang-1、Hif-1-α、HGF和IGF-1等多種生長(zhǎng)因子參與，這些生長(zhǎng)因子在血管形成過(guò)程中表達(dá)上調(diào)[20-22]。為從基因?qū)用骝?yàn)證聯(lián)合應(yīng)用VEGF-165與PDGF-BB對(duì)血管化的促進(jìn)作用優(yōu)于單獨(dú)使用VEGF-165或PDGF-BB一種生長(zhǎng)因子的效果，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PT-PCR法檢測(cè)Ang-1、Hif-1-α、HGF和IGF-1的基因表達(dá)。結(jié)果表明，術(shù)后2周及4周V+P組較V組及P組能更顯著地上調(diào)Ang-1、Hif-1-α、HGF和IGF-1的基因表達(dá)(P<0.05)。說(shuō)明了聯(lián)合應(yīng)用VEGF-165與PDGF-BB對(duì)新血管生成的效果優(yōu)于單一使用一種生長(zhǎng)因子，起到了協(xié)同促進(jìn)作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證明了VEGF-165與PDGF-BB在促進(jìn)新血管生成方面起到了協(xié)同作用。與單獨(dú)使用一種生長(zhǎng)因子相比，聯(lián)合VEGF-165與PDGF-BB能顯著增加新生血管的數(shù)量，并有利于維持完整的血管結(jié)構(gòu)，對(duì)其進(jìn)行良好的應(yīng)用將對(duì)組織工程骨的血管化及組織工程骨移植修復(fù)大范圍骨缺損起到積極作用。本實(shí)驗(yàn)的不足之處在于，生長(zhǎng)因子的半衰期較短，不能長(zhǎng)期在體內(nèi)維持其有效濃度，因而缺乏長(zhǎng)期的效果觀察，進(jìn)一步研究希望能延長(zhǎng)生長(zhǎng)因子的作用時(shí)間。同時(shí)VEGF-165與PDGF-BB協(xié)同作用的機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。