李國華 張成建 艾萬朝 張軍翔

結(jié)腸癌是最常見的消化道惡性疾病之一，直腸與乙狀結(jié)腸交界處為其常見的發(fā)病部位[1]；治療主要包括手術(shù)及輔助放化療[2]，但由于其早期癥狀不典型，確診時常常已是中晚期，同時術(shù)后轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)率也是影響患者預(yù)后的重要因素[3]。完整結(jié)腸系膜切除(complete mesocolic excision,CME)手術(shù)是結(jié)腸癌規(guī)范化手術(shù)項目，要求完整切除病灶以及最大程度清掃淋巴結(jié)，研究表明其可明顯提高結(jié)腸癌患者生存率[4]。奧沙利鉑聯(lián)合卡培他濱是目前結(jié)腸癌的一線化療方案，研究表明其治療結(jié)腸直癌療效明確，安全性高[5]。免疫治療是近幾年較為熱門的腫瘤治療新興方法，主要包括細胞免疫治療、腫瘤疫苗及小分子藥物等[6]，其中樹突狀細胞-細胞因子誘導(dǎo)殺傷細胞(dendritic cell-cytokine induced killer,DC-CIK)是通過體外激活腫瘤抗原特異性的DC-CIK免疫細胞，回輸至患者體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤細胞作用[7]。同時，結(jié)腸癌的早期診斷及預(yù)后判斷對患者生存狀況有重要意義，人類表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)及APE1自身抗體(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 autoantibodies，APE1-AAbs)是近年研究較多的結(jié)腸癌診斷因子[8,9]，并與病情程度密切相關(guān)。本試驗旨在探討CME術(shù)后DC-CIK細胞免疫治療聯(lián)合奧沙利鉑、卡培他濱治療結(jié)腸癌對血清HER2和APE1自身抗體水平的作用，以明確其臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以2014年9月至2016年7月在我院就診的82例結(jié)腸癌CME術(shù)后患者為研究對象，按隨機數(shù)字表法分成對照組(n=41)和試驗組(n=41)。對照組中，男18例，女23例；平均年齡(54.33±6.28)歲；分期：Ⅱ期10例，Ⅲ期31例；病理類型：腺癌28例，粘液癌10例，未分化癌3例。試驗組中，男19例，女22例；平均年齡(55.42±6.19)歲；分期：Ⅱ期9例，Ⅲ期32例；病理類型：腺癌30例，粘液癌9例，未分化癌2例。2組性別比、年齡、分型等一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。2組患者治療由同一組具有結(jié)腸癌治療經(jīng)驗的醫(yī)師施行。本研究在試驗前已由醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：年齡>18歲；經(jīng)病理檢查符合結(jié)腸癌診斷標準[10]；首次行CME且術(shù)前未接受過放化療。

1.2.2 排除標準：結(jié)腸癌伴遠處轉(zhuǎn)移；對化療耐受差；預(yù)期壽命<3個月；合并其他腫瘤患者；合并心、肝、腎等系統(tǒng)疾?。粚Ρ狙芯克幬镞^敏者；拒絕簽署知情同意書。

1.3 治療方法 對照組采用奧沙利鉑(江蘇恒瑞醫(yī)藥公司，規(guī)格：100 ml∶0.1 g)劑量130 mg/m2，溶于5%葡萄糖溶液(河南華利藥業(yè)有限責(zé)任公司，規(guī)格：500 ml∶25 g)500 ml中，緩慢靜脈滴注3 h，第1天；卡培他濱片(上海羅氏制藥公司，規(guī)格：0.5 g/12片)治療，1 g/m2，口服，早晚各1次，第1～14天，完成1個周期化療(共4周)，完成6個周期治療。試驗組在對照組的基礎(chǔ)上，分別在化療開始前、化療3周及6周期后各行DC-CIK細胞免疫治療1個周期，將制備完成的DC于腹股溝淋巴結(jié)處皮下注射，每周期3次共注入(3～5)×108個細胞，同時將制備完成的CIK行靜脈輸注，1次/d，每次完成輸注后行IL-2注射液100萬單位靜脈滴注，每周期5次共輸注5×109個細胞。

1.4 DC-CIK細胞制備方法 (1)患者全腫瘤抗原制備：取患者腫瘤組織標本大小1 cm×1 cm×0.5 cm，取材不可包含壞死及正常組織，慶大霉素溶液沖洗3次后置于8萬U慶大霉素溶液浸泡，-80℃凍存；37℃水浴箱復(fù)溫1640培養(yǎng)基沖洗3次后剪碎組織在200目網(wǎng)塞上研磨，1640培養(yǎng)基沖洗留沖洗液-80℃凍存，37℃水浴箱復(fù)溫，1 500 r/min離心15 min，留取上清液即為患者全腫瘤抗原，核對患者編號，-80℃凍存?zhèn)溆谩?2)DC腫瘤疫苗及CIK制備：予患者注射200 μg 重組人粒細胞刺激因子，24 h后抽取外周血100 ml，肝素管抗凝，F(xiàn)icoll梯度離心法分離單個核細胞，用1640培養(yǎng)基沖洗3次后將分離所得細胞懸浮于1640培養(yǎng)基中，細胞濃度2×106個/ml，置于37℃、2%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，貼壁細胞即為DC，懸浮細胞即為CIK。將細胞懸浮液吸出作為CIK培養(yǎng)，將DC加入DC培養(yǎng)基培養(yǎng)(含慶大霉素40 U/ml，白細胞介素420 ng/ml，粒單細胞集落刺激因子50 ng/ml)，每48小時換液，培養(yǎng)第6天加入患者全腫瘤抗原及RH-TNF 15 ng/ml，孵育1 d，即得DC腫瘤疫苗，0.9%氯化鈉溶液洗滌，抽取小部分混入CIK培養(yǎng)，剩余配入1%人血白蛋白制成DC腫瘤疫苗(2 ml/支)；CIK培養(yǎng)(含γ-干擾素1 000 U/ml，IL-2 500 U/ml)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 d，加入抗CD3單抗100 μg/ml和IL-15 10 U/ml,每72小時更換培養(yǎng)液，保持細胞濃度2×106個/ml，10 d后取細胞液行流式分析，確認無微生物污染，0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，配入1%人血白蛋白制成DC-CIK細胞液(200 ml/袋)。

1.5 觀察指標

1.5.1 臨床療效：分別于治療前、治療后2周、治療后2年抽取患者3 ml外周靜脈血，賽默飛離心機以3 000 r/min速度離心10 min，取血清冷凍保存待檢(-20℃保存)，使用人CEA酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(上海信裕公司產(chǎn)，操作嚴格參照說明書)測定CEA數(shù)值。治療期間及治療后2年內(nèi)定期隨訪(包括血常規(guī)、腫瘤標志物、結(jié)腸鏡、腹部B超及CT，必要時行PET檢測)，評估復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移情況，記錄2組患者2年腫瘤復(fù)發(fā)率。

1.5.3 血清HER2及APE1-AAbs水平：分別于治療前、治療后2周、治療后2年抽取患者3 ml外周靜脈血，賽默飛離心機以3 000 r/min速度離心10 min，取血清冷凍保存待檢(-20℃保存)，使用HER2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(上海仁捷科技有限公司產(chǎn)，操作嚴格參照說明書)，APE1-AAbs酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(上海江萊生物科技公司產(chǎn)，操作嚴格參照說明書)測定血清HER2及APE1-AAbs水平。

1.5.4 不良反應(yīng)：記錄治療過程中發(fā)生的不良事件，評價治療安全性。

2 結(jié)果

2.1 2組患者臨床療效比較 治療前，2組CEA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后2周，2組CEA水平明顯降低(P<0.05)，試驗組明顯低于對照組(P<0.05)；治療后2年，2組CEA水平較治療后2周明顯升高，且對照組顯著高于試驗組(P<0.05)，且2組間不同時間點及組間時間點交互作用差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。治療2年后，試驗組及對照組2年腫瘤復(fù)發(fā)率分別為9.76%、26.83%，試驗組明顯低于對照組(P<0.05)。見表1、2。

組別CEA治療前治療后2周治療后2年對照組20.71±10.744.27±2.14?10.27±4.73#試驗組21.25±11.093.14±2.10?△5.70±3.52#△組間F=2.320,P=0.020不同時間點F=2.830,P=0.005組間?不同時間點F=3.532,P=0.000

注：與治療前比較，*P<0.05；與治療后2周比較，#P<0.05；與對照組比較，△P<0.05

表2 2組2年腫瘤復(fù)發(fā)率比較 n=41，例

2.3 2組患者血清HER2及APE1-AAbs水平比較 治療前，2組患者HER2及APE1-AAbs表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后，2組血清HER2及APE1-AAbs水平較治療前均明顯減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且試驗組顯著低于對照組(P<0.05)，治療2年后，2組血清HER2及APE1-AAbs水平均較前升高，且對照組顯著高于試驗組(P<0.05)，且2組間不同時間點及組間時間點交互作用差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

2.4 2組患者不良反應(yīng)情況比較 治療過程中，試驗組出現(xiàn)注射部位皮損2例，發(fā)熱5例，均經(jīng)對癥處理后12 h內(nèi)出現(xiàn)好轉(zhuǎn)；2組患者在骨髓抑制、消化道癥狀(如惡心、嘔吐及腹瀉)、外周神經(jīng)損傷及手足綜合征等不良反應(yīng)方面呈現(xiàn)明顯差異，且試驗組明顯低于對照組(P<0.05)。見表5。

注：與治療前比較，*P<0.05；與治療后2周比較，#P<0.05；與對照組比較，△P<0.05

組別HER2(mg/L)治療前治療后2周治療后2年APE1-AAbs(ng/L)治療前治療后2周治療后2年對照組20.46±4.678.82±3.27?14.32±8.13#10.87±2.706.37±2.18?9.54±8.17#試驗組18.78±4.825.27±4.15?△7.79±5.28#△11.12±3.044.72±2.53?△5.70±6.22#△組間F=9.350,P=0.000F=11.470,P=0.000不同時間點F=5.970,P=0.000F=7.030,P=0.000組間?不同時間點F=7.430,P=0.000F=9.400,P=0.000

注：與治療前比較，*P<0.05；與治療后2周比較，#P<0.05；與對照組比較，△P<0.05

表5 2組不良反應(yīng)率比較 n=41，例(%)

3 討論

結(jié)腸癌主要病理類型包括腺癌、粘液腺癌及未分化癌等，中晚期結(jié)腸癌治療難度大，存在對化療不敏感情況，術(shù)后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[11]。DC-CIK免疫治療是近幾年腫瘤治療方面的熱點，通過調(diào)節(jié)腫瘤免疫機制產(chǎn)生抗腫瘤作用，研究表明其在結(jié)腸癌輔助治療中可提高患者免疫功能[12]。在結(jié)腸癌早期診及病情判斷方面研究也不斷深入[13]，HER2及APE1-AAbs是與腫瘤免疫相關(guān)的因子，研究表明其與結(jié)腸癌病情預(yù)后相關(guān)[14]。本試驗旨在探究CME術(shù)后 DC-CIK細胞免疫治療聯(lián)合奧沙利鉑、卡培他濱對結(jié)腸癌血清HER2和APE1-AAbs水平的作用，以明確其臨床應(yīng)用價值。

HER2屬于酪氨酸激酶活性蛋白，與細胞增殖分化、血管生成等過程密切相關(guān)，研究證明其高表達導(dǎo)致細胞增殖分化失控，促進細胞惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤轉(zhuǎn)移，研究發(fā)現(xiàn)HER2可作為多種腫瘤如結(jié)腸癌的診斷及預(yù)后評價指標[8]。APE1是一種DNA損傷修復(fù)蛋白，參與DNA損傷修復(fù)及多種轉(zhuǎn)錄因子如P53等的調(diào)控；結(jié)腸癌患者APE1異常表達刺激機體產(chǎn)生APE1-AAbs，APE1-AAbs可作為結(jié)腸癌輔助診斷因子[19]。本試驗結(jié)果表明，治療2周后，2組血清HER2及APE1-AAbs水平較治療前均明顯減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且試驗組顯著低于對照組(P<0.05)，治療2年后，2組血清HER2及APE1-AAbs水平均較前升高，且對照組顯著高于試驗組(P<0.05)；分析其可能原因，DC-CIK細胞免疫治療聯(lián)合奧沙利鉑、卡培他濱治療采用一線化療方案與DC-CIK免疫治療聯(lián)合，可在化療方案控制腫瘤病情基礎(chǔ)上引入免疫細胞，增強患者免疫功能，調(diào)節(jié)患者腫瘤免疫失衡狀態(tài)，試驗結(jié)果表明治療后負性Treg細胞對照組明顯高于試驗組，DC-CIK細胞免疫治療調(diào)節(jié)了腫瘤組織抑制的免疫微環(huán)境，發(fā)揮更好的抗腫瘤作用，降低了腫瘤負荷，降低了降低結(jié)腸癌患者的血清HER2和血清APE1自身抗體水平。王鐵等[20]研究表明，DC-CIK細胞免疫治療聯(lián)合奧沙利鉑、卡培他濱治療結(jié)腸癌可降低CEA水平，控制腫瘤復(fù)發(fā)并調(diào)節(jié)腫瘤免疫，改善患者生存狀態(tài)，結(jié)果與本研究相符。

在藥物安全性及不良反應(yīng)方面，試驗組在骨髓抑制、消化道癥狀(如惡心、嘔吐及腹瀉)、外周神經(jīng)損傷及手足綜合征等不良反應(yīng)方面呈現(xiàn)明顯明顯低于對照組，說明DC-CIK細胞免疫治療聯(lián)合奧沙利鉑、卡培他濱治療在結(jié)腸癌治療中安全性好，耐受度較好。

綜上所述，CME術(shù)后 DC-CIK細胞免疫治療聯(lián)合奧沙利鉑、卡培他濱可提高結(jié)腸癌患者的療效，改善機體免疫功能,降低結(jié)腸癌患者的血清HER2和APE1-AAbs水平。