許寅聰 陳靜 趙亞芳 王超英 仝春梅 劉迎慶 韓寶雁

高度近視已經(jīng)引起了全社會的關(guān)注，近年全世界高度近視患者數(shù)量急劇增長，預(yù)測到2020年全球約有20億的近視患者[1,2]，這勢必嚴重干擾了社會的正常發(fā)展。中國是高度近視的高發(fā)國家，患病率為6.69%～38.4%[3-5]。近視之所以引起全社會的關(guān)注是因為高度近視是常見的致盲性眼病，且在致盲性眼病中的比例迅速增長。尤其是病理性近視患者，因后鞏膜終生持續(xù)擴展，眼軸終生增長，最終引起眼球后段局限或大面積缺血，進而損害視網(wǎng)膜功能，并誘發(fā)并發(fā)癥的發(fā)生[6,7]。既往一些研究表明病理性近視的發(fā)生及并發(fā)癥的出現(xiàn)與鞏膜的生物力學降低有關(guān)[8,9]。隨著核黃素-紫外光A角膜膠原交聯(lián)手術(shù)治療圓錐角膜技術(shù)的應(yīng)用并取得良好的臨床效果[10,11]，使得病理性近視的研究有了新的方向，增強鞏膜生物力學的研究也成為了新的熱點，研究是希望通過增強后部1/2鞏膜的應(yīng)力、應(yīng)變、彈性模量等，起到阻止或延緩后鞏膜持續(xù)擴展的作用，最終實現(xiàn)治療病理性近視的目的[12,13]。京尼平是一種低毒性和優(yōu)良生物相容性的天然交聯(lián)劑，我們既往研究也發(fā)現(xiàn)其具備較強的鞏膜交聯(lián)效應(yīng)[14]。本研究希望通過直接對比研究甲醛緩釋體類防腐劑和京尼平對活體成年兔鞏膜交聯(lián)后的后鞏膜生物力學強度的改變來衡量其有效性，最終篩選出具有較強鞏膜膠原交聯(lián)效應(yīng)的藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康新西蘭大白兔，數(shù)量100只，來源為河北醫(yī)科大學實驗動物中心，年齡約為1年齡，雌雄不限，體重為(1.69±0.14)kg，飼養(yǎng)地點為聯(lián)勤保障部隊第九八○醫(yī)院動物實驗中心，有中心飼養(yǎng)員進行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為室溫20～23℃，每日接受日光或燈光12 h。入組前經(jīng)過便攜式筆形手電逐步檢查每只兔雙眼外眼瞼、角膜和瞳孔均未見明顯異常。本研究所涉及的所有兔動物試驗都已經(jīng)取得中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八○醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準(批準編號2018-KY-09)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組及模型建立:將100只兔隨機分為5組(隨機數(shù)字表法)，每組20只，分別為 3組FARs藥物組(羥甲基甘氨酸鈉組、重氮咪唑烷基脲組、惡唑烷組)，京尼平組和空白對照組。右眼為實驗眼(由拋硬幣法選出)。給藥方法為：選擇鼻上1∶00和顳下7∶00位角膜緣后3 mm進針Tenon’s囊下各1次，左眼均未予以任何處理。見表1。

表1 京尼平和甲醛緩釋體類防腐劑給藥濃度及劑量 n=20

1.2.2 鞏膜生物力學參數(shù)測量

1.2.2.1 樣本制備:最后一次給藥后60 d，5組兔體重見表2(F=0.779，P=0.549)。耳前靜脈空氣栓塞法逐組處死動物兔，摘取實驗眼球，保留眼外肌和視神經(jīng)，并編號標記，然后按操作順序依次放入保存液1中，成分為25%的新生牛血清、2.5%的蔗糖、2%的DMSO、滅菌注射用水；保存液2，成分為25%的新生牛血清、5.5%的蔗糖、4%的DMSO、滅菌注射用水；保存液3，成分為25%的新生牛血清、7.5%的蔗糖、6%的DMSO、滅菌注射用水，每眼球在這3種保存液中均浸泡10 min，最終放入保存液4中，成分為25%的新生牛血清、10%的蔗糖、7.5%的DMSO、滅菌注射用水。之后帶保存液4放入編號的保存盒中密封，之后放入液氮罐中保存。連同液氮罐一起運輸?shù)教砉ご髮W國家力學實驗室中，將密封在保存液4中的兔眼從液氮罐中取出，放入37℃恒溫水浴箱中復(fù)溫2 h，取標本1∶00和7∶00位眼外肌止端后的鞏膜，制成長10 mm寬5 mm的長方形鞏膜條帶。見表2。

組別體重羥甲基甘氨酸鈉組1.61±0.19重氮咪唑烷基脲組1.67±0.14惡唑烷組 1.69±0.10京尼平組 1.67±0.13空白對照組 1.66±0.17

1.2.2.2 生物力學的測試:首先逐條測量鞏膜條帶的厚度，測量儀器由力學實驗室提供，測量3次，取均值，所有測量由同一人完成，之后將鞏膜條帶用夾具固定好兩端，微調(diào)夾具，使試件松緊適度，并實時觀察拉力情況，以靜止時拉力為-0.5～+0.5 N為標準，然后測量固定好的鞏膜條帶長度并按照編號記錄，使用INSTRON 5544型萬能材料試驗機進行力學實驗，實驗程序順序為蠕變實驗，預(yù)拉伸實驗，拉伸強度實驗、拉伸破壞實驗，試驗期間保持鞏膜條帶濕潤，之后計算出試件彈性模量、蠕變率、極限應(yīng)力和極限應(yīng)變。

2 結(jié)果

2.1 鞏膜厚度 實驗后5組鞏膜厚度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

組別鞏膜厚度(mm)羥甲基甘氨酸鈉0.30±0.04重氮咪唑烷基脲0.29±0.07惡唑烷 0.32±0.03京尼平組 0.31±0.05空白對照組 0.30±0.03F值1.375P值0.249

2.2 極限應(yīng)力 4個試驗組的極限應(yīng)力均較空白組增大，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中羥甲基甘氨酸鈉表現(xiàn)出最強的交聯(lián)能力，極限應(yīng)力增強最明顯為(1.33±0.50)MPa，為空白對照組的2.18倍。其次表現(xiàn)較好的為重氮咪唑烷基脲組和惡唑烷組。表現(xiàn)最差的京尼平組。三種FARs藥物(羥甲基甘氨酸鈉、重氮咪唑烷基脲組、惡唑烷組)與京尼平相比較增強極限應(yīng)力的能力差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，F(xiàn)ARs更強效。見表4，圖1。

組別極限應(yīng)力(MPa)羥甲基甘氨酸鈉1.33±0.50?#重氮咪唑烷基脲1.28±0.37?#惡唑烷 1.23±0.35?#京尼平組 0.86±0.31?空白對照組 0.61±0.27F值13.781P值<0.001

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與京尼平組比較，#P<0.05

圖1 試驗后不同藥物分組的鞏膜極限應(yīng)力情況

2.3 極限應(yīng)變 4個試驗組極限應(yīng)變均較空白組出現(xiàn)了顯著的降低，且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中重氮咪唑烷基脲組表現(xiàn)出最強的交聯(lián)能力，極限應(yīng)變?yōu)?28.04±7.45)%，較空白對照組降低了27.05%。其次表現(xiàn)較好的為羥甲基甘氨酸鈉組和惡唑烷組。表現(xiàn)最差的為京尼平組。三種FARs藥物(羥甲基甘氨酸鈉、重氮咪唑烷基脲組、惡唑烷組)與京尼平相比較，重氮咪唑烷基脲組能更顯著的降低極限應(yīng)變(P=0.035)。見表5，圖2。

組別極限應(yīng)變(%)羥甲基甘氨酸鈉30.19±7.91?重氮咪唑烷基脲28.04±7.45?#惡唑烷 29.83±5.55?京尼平組 32.32±5.97?空白對照組 38.44±4.81F值8.086P值<0.001

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與京尼平組比較，#P<0.05

2.4 彈性模量變化 4個試驗組彈性模量均較空白組出現(xiàn)了增加，其中羥甲基甘氨酸鈉組表現(xiàn)出最強的交聯(lián)能力，彈性模量為(7.70±1.94)MPa，為空白對照組的2.14倍。其次表現(xiàn)較好的為重氮咪唑烷基脲組和惡唑烷組。表現(xiàn)最差的京尼平組。3種FARs藥物(羥甲基甘氨酸鈉、重氮咪唑烷基脲組、惡唑烷組)與京尼平相比較增強彈性模量的能力差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，F(xiàn)ARs更強效。見表6，圖3。

圖2 試驗后不同藥物分組的鞏膜極限應(yīng)變情況

組別彈性模量(MPa)羥甲基甘氨酸鈉7.70±1.94?#重氮咪唑烷基脲7.21±1.84?#惡唑烷 7.15±1.31?#京尼平組 5.00±1.11?空白對照組 3.60±2.84F值26.459P值<0.001

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與京尼平組比較，#P<0.05

圖3 試驗后不同藥物分組的鞏膜彈性模量情況

2.5 蠕變率 4個試驗組蠕變率均較空白組出現(xiàn)了顯著的降低，且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中惡唑烷組的蠕變率最低為(7.69±2.68)%，較空白對照組降低了34.92%。其次表現(xiàn)較好的為重氮咪唑烷基脲組和羥甲基甘氨酸鈉組。表現(xiàn)最差的為京尼平組。3種FARs藥物(羥甲基甘氨酸鈉、重氮咪唑烷基脲組、惡唑烷組)與京尼平相比較，惡唑烷組能更顯著的降低極限應(yīng)變(P=0.004)。見表7，圖4。

組別蠕變率(%)羥甲基甘氨酸鈉8.26±3.19?重氮咪唑烷基脲9.12±2.51?惡唑烷 7.69±2.68?#京尼平組 9.36±2.10?空白對照組 11.82±1.58F值15.388P值<0.001

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與京尼平組比較，#P<0.05

圖4 試驗后不同藥物分組的鞏膜蠕變率情況

3 討論

病理性近視的發(fā)病機制仍不清楚，但已經(jīng)有研究表明病理性近視的發(fā)生發(fā)展與鞏膜的生物力學下降和鞏膜自身解構(gòu)特點有關(guān)，從眼球自身解剖來看視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜、鞏膜構(gòu)成了眼球的大部分外殼，從生物力學性能來看，在相同應(yīng)力的作用下，三層結(jié)構(gòu)切線模量呈數(shù)量級遞增[15]。在病理性近視的發(fā)展過程中，鞏膜各層生物力學出現(xiàn)改變表現(xiàn)出顯著下降，當鞏膜生物力學性能下降出現(xiàn)擴張的時候，視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜會緊跟著出現(xiàn)快速擴張，進而引起一系列高度近視病變，比如黃斑部新生血管和(或)出血、視網(wǎng)膜(黃斑)劈裂、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜(黃斑)裂孔、后鞏膜葡萄腫等，進而引起視功能的明顯損害[16]。遺憾的是目前臨床上尚無公認有效地治療或控制病理性近視發(fā)生發(fā)展的手段，應(yīng)用相對廣泛的是后鞏膜加固術(shù)[17,18]，其可以保持或提高患者最佳矯正視力、阻止或延緩眼軸進一步增長[19]，但長期效果、手術(shù)方法、加固材料選擇方面尚存爭議[20]。有學者也發(fā)現(xiàn)了部分與病理性近視有關(guān)的基因[21,22]，如PAX6基因、LUM基因、IGF基因、轉(zhuǎn)化生長因子-β1、rs2536等30多個位點基因，但距離臨床應(yīng)用仍待時日，所以探索新的治療方法迫在眉睫。

鞏膜膠原交聯(lián)是近年的一個研究概念，這是受到核黃素-紫外光A角膜膠原交聯(lián)手術(shù)治療圓錐角膜所啟發(fā)。鞏膜交聯(lián)治療病理性近視的原理是通過物理或者化學方法增強鞏膜的生物力學強度，進而緩解鞏膜擴展，延緩眼球增長，進而達到控制病理性近視致盲的目的。本研究就是探討化學藥物方法的鞏膜交聯(lián)有效性。探討了2類藥物，第一類是甲醛緩釋體類防腐劑(FARs)，其是一類化合物，約有100多種，廣泛應(yīng)用于洗護用品、紡織等產(chǎn)品中，我們?nèi)粘Ｉ钪袝r刻都在接觸此類化合物，但未見到其直接致癌的報道，歐盟對各種FARs的安全劑量有著較為明確的限定，我們前期通過查閱文獻初步篩選除了5種較為有潛質(zhì)的FARs，第二類是京尼平，京尼平是一類提取自天然植物的化合物，有著良好的安全性。Babar等[23]通過觀察FARs交聯(lián)后鞏膜的熱變性溫度和FARs對人皮膚成纖維細胞的毒性反應(yīng)認為其是強效、低毒性的交聯(lián)劑。本實驗選擇的FARs藥物種類是參照了既往研究[24]，濃度則參考了歐盟理事會關(guān)于FARs的法令，選擇的是1/10最大允許安全濃度。動物模型選擇兔是因為，本課題組具有成熟的幼兔形覺 剝奪模型建立的經(jīng)驗，同時成年兔標本容易獲得，體重易控制，故本文則對這4種藥物的有效性進行了活體兔試驗研究。

從本研究結(jié)果看，京尼平和三種FARs藥物(羥甲基甘氨酸鈉、重氮咪唑烷基脲、惡唑烷)均表現(xiàn)出了明顯的交聯(lián)效應(yīng)，鞏膜的生物力學的強度明顯增強了，這包括極限應(yīng)變、極限應(yīng)力、彈性模量和蠕變率4個方面均有了顯著增強。但要知道這些交聯(lián)藥物的交聯(lián)效果都與濃度正相關(guān)。在1/10最大允許濃度下的四種生物力學指標來看，極限應(yīng)力最多增大2.18倍(羥甲基甘氨酸鈉組)、極限應(yīng)變最多降低27.05%(重氮咪唑烷基脲組)、彈性模量最多增大2.14倍(羥甲基甘氨酸鈉組)、蠕變率最多降低34.92%(惡唑烷組)。京尼平組極限應(yīng)力增大1.41倍，極限應(yīng)變降低16%，彈性模量增大1.39倍，蠕變率降低20.81%。這點與國內(nèi)外學者既往研究類似。Campbell等[25,26]研究認為京尼平鞏膜交聯(lián)可增強鞏膜生物力學強度60%。Zyablitskaya等[27]發(fā)現(xiàn)羥甲基甘氨酸鈉的鞏膜交聯(lián)效應(yīng)具備明顯的濃度效應(yīng)，400 mmol/L濃度的藥物交聯(lián)強度是40 mmol/L的6倍。除了本實驗研究的化學藥物鞏膜交聯(lián)，賈冠美[28]開展了核黃素-紫外光A角膜物理膠原交聯(lián)，發(fā)現(xiàn)使用功率3.0 mW/cm2，波長370 nm的紫外線燈聯(lián)合0.1%的5-磷酸核黃素，對兔鞏膜照射20 min的方法，兔鞏膜彈性模量增加了26.31%，極限應(yīng)力增加了12.21%，蠕變率降低了40.47%。Liu等[29]對豚鼠進行了UVA-核黃素鞏膜膠原交聯(lián)實驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)能顯著增強鞏膜生物力學強度。

本研究通過對活體兔后Tenon’s囊下注射羥甲基甘氨酸鈉、重氮咪唑烷基脲、惡唑烷和京尼平4種藥物后鞏膜生物力學參數(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，4種藥物均具備較強的鞏膜膠原交聯(lián)效應(yīng)，能夠顯著提高后鞏膜生物力學強度，具備治療病理性近視的潛能。綜合數(shù)據(jù)來看FARs較京尼平具備更顯著的增強鞏膜生物力學強度的能力，但因為化學交聯(lián)效應(yīng)與濃度正相關(guān)，所以這可能與不同種類藥品的濃度差異有關(guān)。我們也會在未來增加安全性相應(yīng)內(nèi)容，最終探索出臨床急需的治療病理性近視可行性的方法，為患者帶來持久的光明。