曹宇峰 張琳琳 呂麗麗 王磊 邊月平

再生障礙性貧血(AA)是由于理化因素、遺傳因素、病毒感染等多種因素引起造血干細胞質/量異常，從而導致骨髓增生極度減低和全血細胞減少的一種血液系統(tǒng)難治性疾病[1-3]。目前認為，AA發(fā)生發(fā)展與T細胞免疫功能異常、造血微環(huán)境調節(jié)紊亂及細胞因子分泌失調等因素導致骨髓免疫損傷有關[4-6]。本課題組采用健脾補腎方治療AA，以AA患者外周血免疫T細胞、血清細胞因子及外周血單個核細胞(PBMCs)轉錄因子表達為指標，進一步深入研究健脾補腎方發(fā)揮治療作用的免疫學機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年1月至2018年6月我院收治的AA患者90例，按照隨機數(shù)字表法隨機分為對照組和治療組，每組45例。對照組男25例，女20例；年齡32～61歲，平均(39.12±5.42)歲；病程1～12年，平均(5.12±0.73)年；中醫(yī)證候分型：脾腎陰虛型10例，脾腎陽虛型19例，脾腎陰陽兩虛型16例；治療組男23例，女22例；年齡30～65歲，平均(40.00±5.51)歲；病程1～14年，平均(5.78±0.82)年；中醫(yī)證候分型：脾腎陰虛型12例，脾腎陽虛型18例，脾腎陰陽兩虛型15例。2組年齡、性別比、病程、中醫(yī)證候分型等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組一般資料比較 n=45

1.2 納入及排除標準 納入標準：(1)符合《血液病診斷及療效標準》制定的再生障礙性貧血診斷標準，且經(jīng)臨床癥狀體征、血常規(guī)指標、骨髓涂片及病理學檢查確診為AA；(2)符合《中藥新藥臨床研究指導原則》制定的中醫(yī)辨證分型診斷標準；(3)入組前2周內未接受過激素、化療藥物治療者；(4)患者均自愿參加本研究，且簽署知情同意書。排除標準：(1)合并PNH、白血病等其他血液系統(tǒng)疾??；(2)合并心、肝、肺、腎等重要臟器功能不全者；(3)妊娠或哺乳期女性；(4)對本研究藥物過敏或有禁忌癥者。

1.3 治療方法 對照組給予環(huán)孢素A治療，口服，4 mg·kg-1·d-1，2次/d；同時根據(jù)病情給予抗感染、補血及止血藥物。治療組給予健脾補腎方治療，組成：黃芪 24 g，女貞子 15g，太子參 24 g，白術芍 15 g，炒丹皮 15 g，制半夏 10g，小薊草 15 g，菟絲子 24 g，炒枳殼 10 g，炙甘草 6 g。1個月為1個療程，共治療2個療程。針對不同中醫(yī)辨證分型，健脾補腎方中分別配伍不同中藥，脾腎陰虛型可選擇滋陰生精的藥物，如生地黃、黃柏等；脾腎陽虛型可選擇填精助陽的藥物，如補骨脂、淫羊藿；脾腎陰陽兩虛型可選擇陰陽雙補的藥物，如杜仲、制首烏等。

1.4 觀察指標及方法

1.4.1 外周血免疫T細胞:分別于治療前后抽取患者外周血5 ml，采用流式細胞儀測定免疫T細胞比例，包括Th、Tc、NK、Th17、Treg細胞，計算Th/Tc、Th1/Th、Th17/Treg比值。

1.4.2 PBMCs轉錄因子表達:采用Real time-PCR法測定PBMCs T-bet、GATA-3、RORγ、Foxp3 mRNA表達。按照TRizol說明書進行骨髓基質細胞總RNA的提取和逆轉錄，SYBR Green染料法進行目的基因擴增，根據(jù)RQ=2-ΔΔCt計算目的基因相對表達量。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。見表2。

1.4.3 血清細胞因子:分別于治療前后抽取患者外周血5 ml，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定TGF-β1、IFN-γ、TNF-α水平。

表2 Real time-PCR引物序列

2 結果

2.1 2組外周血淋巴細胞亞群比較 治療前2組外周血Th、Tc、NK細胞比例及Th/Tc比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后2組外周血Th、NK細胞比例及Th/Tc均明顯高于治療前，Tc細胞比例均明顯低于治療前，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且治療組Th、NK細胞比例及Th/Tc高于對照組，Tc細胞比例低于對照組(P<0.05)。見表3。

2.2 2組外周血Th1、Th2細胞比較 治療前2組外周血Th1、Th2細胞比例及Th1/Th2比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后2組外周血Th1細胞比例及Th1/Th2均明顯低于治療前，Th2細胞比例均明顯高于治療前，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且治療組Th1細胞比例及Th1/Th2低于對照組，Th2細胞比例高于對照組(P<0.05)。見表4。

2.3 2組外周血Th17、Treg細胞比較 治療前2組外周血Th17、Treg細胞比例及Th17/Treg比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后2組外周血Th17細胞比例及Th17/Treg均明顯低于治療前，Treg細胞比例均明顯高于治療前，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且治療組Th17細胞比例及Th17/Treg低于對照組，Treg細胞比例高于對照組(P<0.05)。見表5。

組別Th(%)Tc(%)Th/TcNK(%)對照組 治療前26.87±4.2541.34±6.230.68±0.129.53±1.24 治療后31.29±4.62?37.00±5.48?0.85±0.14?12.89±1.67?治療組 治療前27.20±4.3140.85±6.180.70±0.139.56±1.29 治療后35.99±5.11?#32.32±4.86?#1.13±0.17?#15.90±2.16?#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

組別Th1(%)Th2(%)Th1/Th2對照組 治療前0.53±0.080.32±0.041.62±0.23 治療后0.44±0.06?0.50±0.07?0.89±0.11?治療組 治療前0.55±0.090.30±0.051.60±0.25 治療后0.31±0.04?#0.78±0.11?#0.42±0.06?#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

組別Th17(%)Treg(%)Th17/Treg對照組 治療前1.23±0.183.11±0.420.43±0.05 治療后0.76±0.11?3.98±0.48?0.22±0.03?治療組 治療前1.20±0.163.08±0.400.41±0.06 治療后0.39±0.06?#4.84±0.53?#0.10±0.02?#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

2.4 2組血清細胞因子水平比較 治療前2組血清TGF-β1、IFN-γ、TNF-α水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后2組血清TGF-β1水平均明顯高于治療前，IFN-γ、TNF-α水平均明顯低于治療前，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且治療組TGF-β1水平高于對照組，IFN-γ、TNF-α水平低于治療組(P<0.05)。見表6,圖1。

2.5 2組PBMCs轉錄因子表達比較 治療前2組PBMCs T-bet、GATA-3、RORγ、Foxp3 mRNA表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后2組PBMCs T-bet、RORγ mRNA表達均明顯低于治療前，GATA-3、Foxp3 mRNA表達均明顯高于治療前，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且治療組T-bet、RORγ mRNA表達低于對照組，GATA-3、Foxp3 mRNA表達高于治療組(P<0.05)。見表7,圖2。

組別TGF-β1IFN-γTNF-α對照組 治療前74.32±10.1480.44±10.89285.76±24.56 治療后118.65±12.54?58.32±8.56?199.54±15.87?治療組 治療前73.68±9.7982.05±12.43292.65±28.55 治療后150.23±14.52?#33.42±4.10?#86.76±11.43?#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

圖1 ELISA測定細胞因子水平

注：與治療前比較,*P<0.05;與對照組比較,#P<0.05

組別T-bet mRNAGATA-3 mRNARORγ mRNAFoxp3 mRNA對照組 治療前0.98±0.130.31±0.041.24±0.200.40±0.06 治療后0.69±0.08?0.52±0.07?0.79±0.13?0.65±0.08?治療組 治療前1.02±0.160.33±0.051.21±0.170.41±0.05 治療后0.42±0.05?#0.89±0.12?#0.30±0.05?#0.98±0.14?#

注：與治療前比較,*P<0.05;與對照組比較,#P<0.05

3 討論

圖2 Real time-PCR法測定轉錄因子表達

注：與治療前比較,*P<0.05;與對照組比較,#P<0.05

研究表明，骨髓微環(huán)境中的多種因素能夠調控T細胞亞群的增殖、分化過程。其中轉錄因子在調控T細胞亞群定向分化中的作用尤為重要。T-bet、GATA-3分別是Th1、Th2特異性轉錄因子，二者間具有相互調節(jié)和抑制作用，T-bet/GATA-3是反映Th細胞失衡的敏感性指標。而RORγ是Th17細胞特異性轉錄因子，具有促進Th17細胞分化并抑制Treg細胞分化的作用。Foxp3是Treg細胞特征性的分子標志物，具有調節(jié)Treg細胞發(fā)育、分化及免疫耐受等作用[15,16]。Du等[17,18]研究顯示，AA患者PBMCs中T-bet、RORγ mRNA表達較正常人顯著升高，GATA-3、Foxp3 mRNA表達較正常人顯著降低，提示AA患者存在Th1/Th2、Th17/Treg失衡，此時Th1、Th17型免疫應答占優(yōu)勢及T細胞活化增加，從而抑制造血干/祖細胞增殖并促進其凋亡，最終導致骨髓造血功能衰竭。因此，檢測T-bet、RORγ、GATA-3、Foxp3表達能夠反映Th1/Th2、Th17/Treg及細胞免疫功能狀態(tài)。本研究采用Real time-PCR檢測了PBMCs中T-bet、RORγ、GATA-3、Foxp3 mRNA表達，結果表明，治療后2組PBMCs中GATA-3、Foxp3 mRNA表達均明顯高于治療前，PBMCs中T-bet、RORγ mRNA表達均明顯低于治療前，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且治療組以上指標改善程度優(yōu)于對照組(P<0.05)。說明健脾補腎方可能通過下調T-bet、RORγ表達，上調GATA-3、Foxp3表達調控T細胞的增殖、分化，糾正細胞免疫功能紊亂，并促進造血功能恢復。

綜上所述，健脾補腎方治療再生障礙性貧血療效顯著，能夠有效調節(jié)T細胞免疫功能，其機制與糾正Th細胞亞群失衡，調節(jié)相關轉錄因子、細胞因子分泌，從而減輕T細胞免疫亢進對骨髓造血的抑制作用。然而，由于Th細胞與轉錄因子、細胞因子間存在相互作用，健脾補腎方作用的具體靶點尚需進一步研究。