宋獻(xiàn)美，許 波，張歡歡，梁瑞峰

(1. 河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 鄭州 451191； 2.河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是癥狀表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥、進(jìn)行性骨破壞的自身免疫性疾病[1]，臨床用藥以糖皮質(zhì)激素、非甾體抗炎藥和抗風(fēng)濕藥為主，不良反應(yīng)較多[2]。牛膝總皂苷為五環(huán)三萜類化合物，是中藥牛膝的重要活性成分，可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖發(fā)揮抗骨關(guān)節(jié)炎的作用[3]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和輔助性T細(xì)胞17(Th17)失衡是RA炎癥病變及骨質(zhì)破壞的重要原因。本研究通過類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型，觀察牛膝總皂苷對(duì)Th17/Treg平衡和滑膜組織中白介素2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的影響，探討其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

雄性SPF級(jí)SD大鼠60只，體質(zhì)量180～200 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(豫)2015-0004。

1.2 藥品、試劑與儀器

牛膝總皂苷， 含量60.3%，購(gòu)自陜西森弗生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20180316；弗氏完全佐劑(批號(hào)SLBT1714)、牛源Ⅱ型膠原(批號(hào)17101015)，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；熒光素異硫氰酸標(biāo)記的抗大鼠CD4+抗體(CD4+-FITC，批號(hào)19001102)、藻紅蛋白標(biāo)記的抗大鼠IL17A抗體(IL17A-PE，批號(hào)51080609)、CD25-PE抗體(批號(hào)36034107)、CD127-PE(批號(hào)20610207)，均為美國(guó)BD公司產(chǎn)品；IL-2(批號(hào)20180913)、IL-6(批號(hào)20180726)、TNF-α(批號(hào)20180718)試劑盒,均為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。Synergy NEO型全功能酶標(biāo)儀，美國(guó)BIO-TEK公司產(chǎn)品；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司產(chǎn)品；RM2245型病理切片機(jī)，德國(guó)Leica公司產(chǎn)品；CX-31型顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組、模型的建立與給藥

將大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組,牛膝總皂苷低、中、高劑量組5組，每組10只。除正常對(duì)照組外，其余大鼠采用Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑1∶1的混合乳劑于右后足底、背部、尾根3點(diǎn)共注射乳化劑0.1 mL的方法建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型[4]。造模后第7 d，牛膝總皂苷低、中、高劑量組分別以牛膝總皂苷60，120，240 μg/g)灌胃，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃等體積的純水，1 d 1次，連續(xù)28 d。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

末次給藥2 h后，眼眶取血并抗凝，麻醉后取右后踝關(guān)節(jié)，分離滑膜。

1.4.1 外周血Th17和Treg水平

以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。用細(xì)胞分離液從抗凝血中分離淋巴細(xì)胞，1640培養(yǎng)液重懸后分別進(jìn)行Th17和Treg的分析。Th17：加入佛波酯(2.5 mg/L)和離子霉素(1.0 mg/L)刺激，加入CD4+-FITC抗體1 μL，孵育20 min，清洗后加破膜劑孵育20 min，然后加入IL17A-PE抗體2 μL，避光孵育30 min，清洗2次。Treg：加入抗CD4+-FITC抗體2 μL、抗CD25-PE抗體2 μL和抗CD127-PE抗體2 μL，孵育30 min后清洗2次。上述處理完成后，均加入500 μL緩沖液重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17和Treg水平。

1.4.2 滑膜組織中IL-2、IL-6和TNF-α水平

采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)。精密稱取50 mg滑膜組織，加入450 μL生理鹽水勻漿，以ELISA 試劑盒測(cè)定滑膜組織勻漿液中IL-2、IL-6和TNF-α的水平。

1.4.3 踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)

大鼠踝關(guān)節(jié)組織經(jīng)40 g/L 多聚甲醛固定，100 g/L EDTA溶液脫鈣，脫水，透明，石蠟包埋，常規(guī)切片，蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠外周血Th17和Treg水平對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠外周血中Th17水平升高，Treg水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對(duì)照組對(duì)比，牛膝總皂苷中、高劑量組大鼠外周血中Th17水平降低，Treg水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

組 別Th17/%Treg/%正常對(duì)照組1.14±0.172.47±0.39模型對(duì)照組2.55±0.48??1.05±0.21??牛膝總皂苷低劑量組2.31±0.431.39±0.25##牛膝總皂苷中劑量組2.16±0.391.72±0.31##牛膝總皂苷高劑量組1.82±0.35##1.93±0.33##

注： 與正常對(duì)照組對(duì)比，**P<0.01；與模型對(duì)照組對(duì)比，##P<0.01。

2.2 各組大鼠滑膜組織中IL-2、IL-6和TNF-α水平對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠滑膜組織中IL-2、IL-6和TNF-α水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對(duì)照組對(duì)比，牛膝總皂苷中、高劑量組大鼠滑膜組織中IL-2、IL-6和TNF-α水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見表2。

組 別IL-2/(ng·g-1)IL-6/(ng·g-1)TNF-α/(ng·g-1)正常對(duì)照組64.37±14.6487.05±21.0873.61±18.11模型對(duì)照組113.29±28.05??191.36±37.22??216.17±43.20??牛膝總皂苷低劑量組98.62±25.19173.36±33.15180.19±36.03牛膝總皂苷中劑量組86.39±24.07#145.07±30.39##146.24±29.17##牛膝總皂苷高劑量組77.53±20.26##121.43±26.58##117.32±24.80##

注： 與正常對(duì)照組對(duì)比，**P<0.01；與模型對(duì)照組對(duì)比，#P<0.05，##P<0.01。

2.3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理變化對(duì)比

光鏡下顯示：正常對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見滑膜增生，無(wú)骨及軟骨破壞。模型對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)不完整，滑膜增厚，排列紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管擴(kuò)張，可見骨及軟骨破壞。與模型對(duì)照組對(duì)比，牛膝總皂苷高、中劑量組大鼠滑膜增生程度、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等均有不同程度改善，見圖1。

A.正常對(duì)照組:結(jié)構(gòu)完整，未見炎性細(xì)胞

B.模型對(duì)照組：滑膜增厚，細(xì)胞排列紊亂，可見大量炎性細(xì)胞

C.牛膝總皂苷低劑量組：滑膜結(jié)構(gòu)破壞，炎性細(xì)胞較模型對(duì)照組減少

D.牛膝總皂苷中劑量組：細(xì)胞排列相對(duì)整齊，可見有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)

E.牛膝總皂苷高劑量組：滑膜結(jié)構(gòu)較完整，可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)

3 討 論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是以慢性滑膜炎為特征的自身免疫性疾病。其發(fā)病原因是抗原對(duì)具有敏感遺傳背景的人產(chǎn)生刺激后，發(fā)生免疫反應(yīng)，但詳細(xì)機(jī)制尚不清楚[5]。在RA患者體內(nèi)，炎性細(xì)胞因子異常已得到驗(yàn)證，尤其是血清中TNF-α、IL-2和IL-6等促炎因子水平顯著升高，并與RA病變程度呈正相關(guān)[6]。TNF-α由RA患者關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜的巨噬細(xì)胞分泌，可誘導(dǎo)滑膜成纖維細(xì)胞活化與增殖，促進(jìn)破骨細(xì)胞的激活與骨吸收，并增加其他炎性細(xì)胞因子、黏附分子及骨與軟骨破壞酶的表達(dá)[7]。IL-2在RA患者的血液及關(guān)節(jié)滑液中大量增加，不僅作為炎性因子參與關(guān)節(jié)滑膜損傷，還參與了全身的免疫平衡紊亂的病理進(jìn)程[8]。IL-6由單核細(xì)胞、T細(xì)胞及滑膜細(xì)胞分泌，能促進(jìn)類風(fēng)濕細(xì)胞因子的產(chǎn)生，放大IL-1和TNF-α的促炎作用，加劇炎癥程度，加重關(guān)節(jié)炎癥病變[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：RA模型大鼠較正常大鼠滑膜組織中IL-2、IL-6和TNF-α水平升高，牛膝總皂苷可降低滑膜組織中IL-2、IL-6和TNF-α的含量。

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡能夠抑制RA的發(fā)生與發(fā)展，但單一的Th1/Th2平衡不能解釋RA的復(fù)雜炎癥機(jī)制[10]。最新研究提示，Th17/Treg分化平衡在RA中起著重要作用[11]。Th17通過產(chǎn)生強(qiáng)致炎因子IL-17來(lái)促進(jìn)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)關(guān)節(jié)滑膜并刺激滑膜成纖維細(xì)胞等分泌IL-2、TNF-α等促炎因子，引起血管翳形成，關(guān)節(jié)軟骨遭到破壞，促進(jìn)關(guān)節(jié)炎癥進(jìn)程。Treg通過分泌IL-10來(lái)抑制TNF-α等促炎因子的釋放，阻止炎癥進(jìn)展，與Th17相互拮抗[12]。調(diào)控Th17/Treg的平衡可成為減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)的重要策略。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠較正常大鼠外周血Th17水平升高，Treg水平降低，牛膝總皂苷可下調(diào)外周血Th17水平，上調(diào)Treg水平。

綜上所述，牛膝總皂苷可明顯改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)組織病理變化，能降低滑膜組織中IL-2、IL-6和TNF-α水平，下調(diào)Th17水平，上調(diào)Treg水平。提示牛膝總皂苷可能通過逆轉(zhuǎn)Th17/Treg的失衡、抑制炎癥因子分泌來(lái)發(fā)揮治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用。