李 斌，郭姝娜，張繼勝

(1.鎮(zhèn)平縣中醫(yī)院，河南 鎮(zhèn)平 474250； 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院風(fēng)濕科，北京 100000)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)好發(fā)于中老年人，以漸進(jìn)性、退行性的關(guān)節(jié)軟骨破壞、骨贅形成及骨質(zhì)增生等為主要表現(xiàn)，多發(fā)生于負(fù)重關(guān)節(jié)，尤以膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)最為多見[1]。研究表明，OA的發(fā)病機(jī)制可能與軟骨細(xì)胞合成和分解之間的動(dòng)態(tài)平衡被打破相關(guān)，由于磨損、負(fù)重、外傷等原因?qū)е玛P(guān)節(jié)軟骨破壞，能進(jìn)一步加重軟骨細(xì)胞膠原蛋白的降解，同時(shí)抑制軟骨細(xì)胞的合成，二者相互作用，使得關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)糜爛、缺失等一系列改變的進(jìn)行性加重[2]。近年來許多研究顯示，OA的發(fā)病并非僅限于關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨組織，與骨、軟骨相關(guān)的滑膜、韌帶及軟骨下骨等都可能發(fā)生病理改變，而這些改變與機(jī)體免疫功能紊亂有著一定相關(guān)性[3]。本研究采用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的補(bǔ)腎活血方干預(yù)KOA大鼠模型，觀察該方對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-3(MMP-3)、基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)及骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)/核因子κB受體活化受體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)軸相關(guān)因子mRNA表達(dá)，以及對軟骨退行性改變組織學(xué)分級評分(Mankin′s評分)的影響，探討補(bǔ)腎活血方對KOA大鼠模型的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

健康雌性Wistar大鼠48只，體質(zhì)量180～220 g，由北京斯貝福生物科技股份有限公司提供，許可證號為SCXK(京)2016-0002。飼養(yǎng)于南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心的屏障環(huán)境中，水瓶給水，自由進(jìn)食。

1.2 藥品、試劑與儀器

補(bǔ)腎活血方藥物組成：骨碎補(bǔ)9 g，補(bǔ)骨脂10 g，桑寄生15 g，川牛膝12 g，雞血藤15 g，丹參10 g，赤芍10 g。由鎮(zhèn)平縣中醫(yī)院顆粒藥房提供配方顆粒。依托考昔片，30 mg/片，杭州默沙東制藥有限公司產(chǎn)品，批號H20080510；灌胃劑量根據(jù)大鼠與人的體表面積比值進(jìn)行換算[4]。木瓜蛋白酶粉劑，25 g/瓶，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，批號Z26149871；SuperScript III RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒，ABI-invitrogen公司產(chǎn)品，批號11752050。5810R型低溫高速離心機(jī)，Eppendorf AG公司產(chǎn)品；核酸濃度測定儀，THERMO公司產(chǎn)品；7900型QPCR儀，ABI公司產(chǎn)品；EPS300電泳儀與2500凝膠成像儀，均為Biorad公司產(chǎn)品。

1.3 分組、模型的建立與給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對照組，模型對照組，依托考昔片組，補(bǔ)腎活血方小、中、大劑量組6組，每組8只。按照文獻(xiàn)[5]分別于第1，4，7天向大鼠雙側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射質(zhì)量分?jǐn)?shù) 40 g/L的木瓜蛋白酶溶液各0.2 mL進(jìn)行造模，正常對照組大鼠不予注射。最后一次注入木瓜蛋白酶溶液后第2天，隨機(jī)選擇2只大鼠進(jìn)行雙側(cè)膝關(guān)節(jié) X線檢查，以確定造模是否成功。大鼠脛骨平臺骨面出現(xiàn)不平整、欠光滑，且關(guān)節(jié)間隙變窄，視為造模成功。確認(rèn)造模成功后，依托考昔片組給予依托考昔3.125 μg/g混懸液灌胃，補(bǔ)腎活血方小、中、大劑量組分別給予補(bǔ)腎活血方0.52，1.04，2.08 g/kg混懸液(10 g 顆粒方相當(dāng)于81 g原藥材)灌胃，正常對照組和模型對照組給予同體積蒸餾水灌胃，1 d 1次，連續(xù)4周。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 一般情況

實(shí)驗(yàn)期間，每天觀察并記錄大鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、活動(dòng)情況，稱量體質(zhì)量。

1.4.2 軟骨退行性改變組織學(xué)分級評分

灌胃4周后，采用100 g/L 水合氯醛腹腔注射麻醉各組大鼠，用骨鉗取右側(cè)膝關(guān)節(jié)股骨髁，減去多余組織，常規(guī)切片脫蠟，蘇木精染色4 min，體積分?jǐn)?shù)10 mL/L 鹽酸酒精分化液分色10 s，伊紅染色3 min，脫水透明封片。鏡下觀察大鼠軟骨的組織結(jié)構(gòu)、軟骨細(xì)胞及軟骨下骨的變化。根據(jù)文獻(xiàn)[6]對軟骨進(jìn)行包括表層軟骨細(xì)胞分裂增生、細(xì)胞排列、軟骨基質(zhì)染色、潮線、血管翳樣物生成5個(gè)方面的軟骨退行性改變組織學(xué)分級評分(Mankin′s評分)。

1.4.3 膝關(guān)節(jié)軟骨MMP-3、MMP-13、OPG、RANKL的mRNA表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測系統(tǒng)(Real-time Quantitative PCR Detecting System ，QPCR)測定。灌胃4周后，采用100 g/L 水合氯醛腹腔注射麻醉各組大鼠，剪開膝關(guān)節(jié)皮膚，取左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)脛骨平臺和股骨內(nèi)外側(cè)髁的退變區(qū)軟骨約10 mg，置于1 mL Trizol中勻漿，加入氯仿200 μL劇烈震蕩混勻，1 400 r/min 離心15 min，取上層水相，加入等體積異丙醇，12 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入體積分?jǐn)?shù)750 mL/L的乙醇混勻，7 500 r/min 離心 5 min，棄上清液，用 50 μL DEPC水溶解沉淀，完成總RNA的提取。冰上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后于ABI7900 QPCR儀上進(jìn)行條帶擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：95 ℃預(yù)變性 2 min、94 ℃變性20 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)的條件進(jìn)行QPCR反應(yīng)，并在60～95 ℃對熔解曲線進(jìn)行分析。將PCR產(chǎn)物與100 bp DNA Ladder進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測 PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物在150 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳，紫外投射儀下觀察擴(kuò)增產(chǎn)物特異條帶。QPCR反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)得到的CT值采用2-ΔΔCt公式計(jì)算KOA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨MMP-3、MMP-13、OPG、RANKL的mRNA表達(dá)。QPCR檢測目的基因引物委托北京Invitrogen公司合成，具體序列見表1。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況

實(shí)驗(yàn)期間所有大鼠在造模后，未出現(xiàn)傷口感染、破潰等情況，均存活。正常組大鼠狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤，飲水及進(jìn)食量適中，雙膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度自如，體質(zhì)量在給藥期間平穩(wěn)上升; 其余各組大鼠在第1次造模后即出現(xiàn)飲水及進(jìn)食減少；第2次和第3次造模后主動(dòng)活動(dòng)逐漸減少，雙側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)活動(dòng)受限，伴舔舐，毛發(fā)漸無光澤，體質(zhì)量減輕。

2.2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin′s評分對比

與正常對照組對比，模型對照組和各藥物組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin′s評分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對照組對比，各治療組Mankin′s評分有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各中藥治療組間具有一定劑量依賴性，大劑量組改善Mankin′s評分的效果最佳。見表2。

組 別n評分/分正常對照組80模型對照組810.96±0.55?依托考昔片組88.73±0.34?#補(bǔ)腎活血方小劑量組88.83±0.76?#補(bǔ)腎活血方中劑量組87.57±0.91?#補(bǔ)腎活血方大劑量組87.23±0.41?#

注：與正常對照組對比，*P<0.05；與模型對照組對比，#P<0.05。

2.3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨MMP-3、MMP-13、OPG、RANKL 的mRNA表達(dá)對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠MMP-3、MMP-13及RANKL mRNA表達(dá)均上調(diào)，而OPG mRNA下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對照組對比，各藥物組的MMP-3、MMP-13及RANKL的mRNA表達(dá)有不同程度下降，其中大劑量組與依托考昔片組類似；而依托考昔片組及中、大劑量補(bǔ)腎活血方組，OPG mRNA表達(dá)上升(P<0.05)，各中藥治療組間結(jié)果呈劑量依賴性。見表3。

組 別MMP-3 mRNAMMP-13 mRNAOPG mRNARANKL mRNA正常對照組0.64±0.370.71±0.171.37±0.210.68±0.11模型對照組1.67±0.83?1.86±0.49?0.82±0.22?1.47±0.31?依托考昔片組0.76±0.24?#0.93±0.21?#1.21±0.23?#1.21±0.27?#小劑量組1.17±0.42?#1.17±0.19?#0.91±0.31?1.38±0.42?中劑量組1.01±0.25?#0.93±0.23?#1.17±0.22?#1.18±0.33?#大劑量組0.87±0.27?#0.91±0.21?#1.19±0.36?#1.07±0.16?#

注：與正常對照組對比，*P<0.05；與模型對照組對比，#P<0.05。

3 討 論

膝骨關(guān)節(jié)炎多發(fā)于中老年人，雖一般不會直接引發(fā)殘疾或?qū)ζ渌到y(tǒng)帶來損傷，但其所致的疼痛、行動(dòng)不便等是影響患者生活質(zhì)量、造成患者生理和心理雙重負(fù)擔(dān)的重要原因[7]。西醫(yī)治療KOA常用消炎止痛藥物，如依托考昔、塞來昔布等。依托考昔作為一種選擇性環(huán)氧化酶-2抑制劑，能有效緩解KOA患者的關(guān)節(jié)疼痛癥狀，減輕患者體內(nèi)炎癥因子水平[8]，但有一定的消化道刺激、水腫等不良反應(yīng)的發(fā)生率。中醫(yī)藥治療KOA具有一定優(yōu)勢，在改善患者關(guān)節(jié)疼痛、保證療效的基礎(chǔ)上，還能改善關(guān)節(jié)軟弱無力、多汗等癥狀，且有較高的安全性，不良反應(yīng)發(fā)生概率低[9]。

MMP是一種能降解細(xì)胞外基質(zhì)的基質(zhì)水解酶，其中MMP-3的降解底物為明膠、蛋白聚糖、Ⅱ和Ⅲ型膠原等，MMP-13的降解底物為Ⅰ、Ⅱ型膠原，均能導(dǎo)致軟骨的破壞，引起骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)行性加重[10]。OPG具有骨保護(hù)作用，能對破骨細(xì)胞的分化產(chǎn)生抑制；而RANKL與之作用相反，能促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和增殖，使得骨破壞進(jìn)一步加重。兩者共同調(diào)節(jié)著骨骼的生長與重建,其動(dòng)態(tài)平衡保證著骨關(guān)節(jié)的正常功能。調(diào)控這些因子能起到治療骨關(guān)節(jié)炎的作用。

KOA屬中醫(yī)學(xué)“骨痹”范疇，以肝腎虧虛為本，脈絡(luò)痹阻為標(biāo)。本虛導(dǎo)致患者易受外邪侵襲，邪氣留存經(jīng)絡(luò)，痹阻不除，不通則痛。補(bǔ)腎活血方將補(bǔ)腎活血與通絡(luò)止痛有機(jī)地結(jié)合起來，一方面用雞血藤、丹參、赤芍等活血通絡(luò)，血脈通則疼痛除；另一方面用骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂、桑寄生、川牛膝等補(bǔ)益肝腎，強(qiáng)筋健骨，補(bǔ)肝腎之虛則正氣充沛，腰膝強(qiáng)勁，并能抵御外邪。本實(shí)驗(yàn)中，補(bǔ)腎活血方能降低KOA模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin′s評分，說明該方對大鼠關(guān)節(jié)軟骨的損傷具有一定的修復(fù)作用；能提高模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)OPG的mRNA表達(dá)，降低MMP-3、MMP-13和RANKL的mRNA表達(dá)水平，說明該方可能是通過調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)腔內(nèi)的骨代謝平衡來改善關(guān)節(jié)軟骨損傷、延緩骨關(guān)節(jié)炎病情的進(jìn)展。本研究豐富了補(bǔ)腎活血方治療KOA的理論基礎(chǔ)，為臨床運(yùn)用該方治療KOA提供了理論依據(jù)。