黃 振,侯有明，郭瓊霞

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,福建 福州 350002;2.福州長(zhǎng)樂(lè)機(jī)場(chǎng)海關(guān),福建 福州350209;3.福州海關(guān)檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,福建 福州 350001)

0 引言

番石榴實(shí)蠅Bactrocera(Bactrocera)correcta(Bezzi)屬雙翅目(Diptera)、實(shí)蠅科(Tephritidae)、寡鬃實(shí)蠅族(Dacini)、果實(shí)蠅屬(Bactrocera)[1]。番石榴實(shí)蠅的分布范圍很廣,現(xiàn)主要在東南亞地區(qū)分布,如泰國(guó)、越南、緬甸、尼泊爾、印度、巴基斯坦、斯里蘭卡等國(guó)家和地區(qū)。1989年,汪興鑒等報(bào)道我國(guó)在云南(元江、漠沙)首次發(fā)現(xiàn)番石榴實(shí)蠅[2];2005年,朱振華等的報(bào)道中其番石榴實(shí)蠅樣品采自云南河口[3]。1996年,梁廣勤等報(bào)道我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)也有番石榴果實(shí)蠅發(fā)生[4]。1986年,美國(guó)的加利福尼亞州第一次發(fā)現(xiàn)了果實(shí)蠅,這也是整個(gè)西半球在野外首次捕捉到番石榴實(shí)蠅。番石榴實(shí)蠅的寄主種類(lèi)很多,有番石榴、櫻桃、桃、蒲桃、蘋(píng)果、番荔枝、芒果、牛油果、人心果、蓮霧、棗、腰果、石榴、扁桃、甜橙、絲瓜、苦瓜、木瓜、番茄、辣椒及柑橘類(lèi)等30科60余種蔬菜和水果等。番石榴實(shí)蠅危害性大,是果蔬生產(chǎn)中的重要害蟲(chóng)[5]。

近幾年,隨著我國(guó)與國(guó)際農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易交流和旅游業(yè)的快速發(fā)展,從境外輸入和旅客攜帶入境的水果、蔬菜的批次、種類(lèi)、數(shù)量明顯增加,加上國(guó)際疫情復(fù)雜,導(dǎo)致檢疫性實(shí)蠅傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)增大[6]。在進(jìn)境的果蔬檢疫中,口岸經(jīng)常截獲到實(shí)蠅類(lèi)害蟲(chóng),由于番石榴實(shí)蠅的形態(tài)特征與其同屬其他種極其相似,尤其是經(jīng)常截獲到實(shí)蠅幼蟲(chóng)、卵或蛹,需飼養(yǎng)為成蟲(chóng)后才可進(jìn)行傳統(tǒng)的分類(lèi)鑒定,所需時(shí)間周期長(zhǎng),飼養(yǎng)環(huán)境條件受限,影響了果蔬的進(jìn)出境貿(mào)易和通關(guān)速度；而且現(xiàn)在對(duì)實(shí)蠅殘?bào)w尚無(wú)法進(jìn)行正確的識(shí)別。為了防止檢疫性有害生物實(shí)蠅傳入以及擴(kuò)散,迫切需要開(kāi)展有關(guān)實(shí)蠅快速鑒定識(shí)別技術(shù)的研究。

近年來(lái),隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,該技術(shù)越來(lái)越多地被應(yīng)用于昆蟲(chóng)不同蟲(chóng)態(tài)的分子鑒定中[7-8],它能解決傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類(lèi)方法難以解決的鑒定問(wèn)題且不受蟲(chóng)態(tài)的影響。種特異引物PCR(Species-specific PCR, SS-PCR)技術(shù)在設(shè)計(jì)目標(biāo)物種的引物時(shí)必須充分考慮引物的特異性,使得在擴(kuò)增未知模板時(shí)能夠根據(jù)目標(biāo)片段條帶的有無(wú)就能把目標(biāo)種類(lèi)與其他近緣種鑒別開(kāi)來(lái)[9-10]。本研究提供了一種采用特異性引物快速鑒定番石榴實(shí)蠅的方法,該方法能夠準(zhǔn)確及時(shí)地對(duì)截獲的疑似番石榴實(shí)蠅的卵、蛹、幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)及殘?bào)w等進(jìn)行鑒定；此外,還建立了一種利用分子手段快速鑒定番石榴實(shí)蠅的方法[11]。

1 供試蟲(chóng)源

本實(shí)驗(yàn)的供試實(shí)蠅有:番石榴實(shí)蠅B.correcta(Bezzi)、楊桃實(shí)蠅B.carambolaeDrew & Hancock、辣椒實(shí)蠅B.latifrons(Hendel)、桔小實(shí)蠅B.dorsalis(Hendel)、具條實(shí)蠅B.scutellata(Hendel)、銹實(shí)蠅B.rubigina(Wang & Zhao)、腿端黑實(shí)蠅B.atrifemurDrew & Hancock、南瓜實(shí)蠅B.tau(Walker)、瓜實(shí)蠅B.cucurbitae(Coquillett)、瘤脛實(shí)蠅B.tuberculata(Bezzi)、黑膝實(shí)蠅B.scutellaris(Bezzi)、何氏華實(shí)蠅B.hochii(Zia)、棗實(shí)蠅CarpomyavesuvianaCosta、顏帶實(shí)蠅B.cilifer(Hendel)、黑顏實(shí)蠅B.diaphoraCoquillett、近黑顏實(shí)蠅B.parater(Zhao & Lin)、五指山實(shí)蠅B.wuzhishanaLin et Yang, sp. nov.、滇寡鬃實(shí)蠅B.modica(Hardy)、瑞麗果實(shí)蠅B.ruiliensisWang, Long et Zhang, sp. nov.、瓜棍腹實(shí)蠅DacuslongicornisWiedemann等20種。實(shí)蠅的蟲(chóng)樣均來(lái)自口岸進(jìn)境果蔬檢疫截獲,并經(jīng)實(shí)蠅鑒定專(zhuān)家復(fù)核；收集的實(shí)蠅蟲(chóng)樣采用75%的酒精浸泡,放置于實(shí)驗(yàn)用的冰箱，備用。

2 試驗(yàn)方法

2.1 DNA提取與質(zhì)量檢測(cè)

2.1.1 模板DNA提取 本試驗(yàn)采用試劑盒法(OMEGA E.Z.N.A.TMInsect DNA Kit)進(jìn)行DNA模板的提取。選取番石榴實(shí)蠅的蛹、幼蟲(chóng)或成蟲(chóng)的整只,或是其成蟲(chóng)的一條腿或是一片翅膀等身體部分,放置于2 mL離心管中,加入適量液氮進(jìn)行充分研磨,具體操作步驟根據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)；將得到的DNA樣品直接保存于-20 ℃冰箱,備用。

2.1.2 DNA質(zhì)量檢測(cè) 利用通用引物上游LCO1490: 5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3’和下游HCO2198: 5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’,對(duì)實(shí)蠅樣本DNA模板的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè),在定量梯度PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng),體系為:2×EasyTaq PCR SuperMix (天根生化科技有限公司)12.5 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板各2 μL,加ddH2O至總體積25 μL。反應(yīng)條件為:94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s,48 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共35個(gè)循環(huán)；最后延伸10 min。分別提取5 μL PCR產(chǎn)物在含DNA染色劑的1.5%瓊脂糖凝膠多功能電泳儀上電泳30 min (120 V),采用凝膠成像分析儀進(jìn)行檢測(cè),檢查是否擴(kuò)增出所需的目標(biāo)片段,拍攝并記錄結(jié)果。

2.2 引物設(shè)計(jì)

利用通用引物L(fēng)CO1490和HCO2198對(duì)番石榴實(shí)蠅進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序,測(cè)序由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行,擴(kuò)增番石榴實(shí)蠅的核酸序列為:

通過(guò)對(duì)番石榴實(shí)蠅的測(cè)序,采用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的BLAST程序檢查篩選同源性較高的序列,下載登錄號(hào)的FASTA格式,利用Bioedit進(jìn)行序列比對(duì),然后根據(jù)SNP位點(diǎn)人工設(shè)計(jì)引物,再利用Oligo 6.44對(duì)引物進(jìn)行評(píng)價(jià),最后利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的Primer-BLAST程序檢查同源序列。

2.3 引物的種特異性的測(cè)試

對(duì)所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行種特異性的檢驗(yàn):選用除番石榴實(shí)蠅外的其它19種實(shí)蠅作為陰性對(duì)照,以番石榴實(shí)蠅為陽(yáng)性對(duì)照,驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)引物的種特異性。SS-PCR在定量梯度PCR儀上進(jìn)行,反應(yīng)體系為:2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL、引物各1 μL、模板各2 μL,加ddH2O至總體積25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30個(gè)循環(huán)；最后延伸7 min。分別提取5 μL PCR產(chǎn)物在含DNA染色劑的1.5%瓊脂糖凝膠多功能電泳儀上電泳30 min (120 V),利用凝膠成像分析儀檢測(cè)是否擴(kuò)增出預(yù)期大小的目標(biāo)片段,拍攝并記錄結(jié)果。

2.4 引物靈敏度的測(cè)試

利用核酸蛋白分析儀測(cè)試提取的番石榴實(shí)蠅DNA模板的濃度。將番石榴實(shí)蠅DNA模板按10-1、10-2、10-3倍梯度稀釋后,使用種特異性引物FR447和FF463-486進(jìn)行PCR擴(kuò)增,測(cè)試該檢測(cè)方法的靈敏度。

2.5 應(yīng)用SS-PCR技術(shù)快速鑒定番石榴實(shí)蠅的應(yīng)用與驗(yàn)證

利用福州機(jī)場(chǎng)旅客攜帶的，以及從福州、云南等口岸進(jìn)境果蔬中截獲的番石榴實(shí)蠅(將番石榴實(shí)蠅飼養(yǎng)到成蟲(chóng)并經(jīng)過(guò)形態(tài)鑒定)的幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)的部分蟲(chóng)體組織(成蟲(chóng)的一條腿、一片翅膀)共19份蟲(chóng)樣,以提取的DNA為模板,使用種特異性引物FR447和FF463-486進(jìn)行PCR擴(kuò)增,來(lái)驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性。

3 結(jié)果與分析

3.1 DNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

對(duì)供試的20種實(shí)蠅蟲(chóng)樣提取的DNA模板,利用通用引物L(fēng)CO1490和HC02198進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果均可見(jiàn)在長(zhǎng)度約700 bp的位置擴(kuò)增出1條單一、清晰的目標(biāo)條帶(圖1)，表明所用通用引物可成功擴(kuò)增供試的20種實(shí)蠅蟲(chóng)樣提取的DNA模板。

M:50 bp DNA Ladder;1:番石榴實(shí)蠅;2:楊桃實(shí)蠅;3:辣椒實(shí)蠅;4:桔小實(shí)蠅;5:具條實(shí)蠅;6:銹實(shí)蠅;7:腿端黑實(shí)蠅;8:南瓜實(shí)蠅;9:瓜實(shí)蠅;10:瘤脛實(shí)蠅;11:黑膝實(shí)蠅;12:何氏華實(shí)蠅;13:棗實(shí)蠅;14:顏帶實(shí)蠅;15:近黑顏實(shí)蠅;16:五指山實(shí)蠅;17:滇寡鬃實(shí)蠅;18:瑞麗果實(shí)蠅;19:黑顏實(shí)蠅;20:瓜棍腹實(shí)蠅;21:空白對(duì)照(ddH2O)。

圖1 利用通用型引物L(fēng)CO1490和HC02198對(duì)提取的實(shí)蠅DNA模板進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)的結(jié)果

3.2 引物的選擇

通過(guò)多重比對(duì),最終選擇的種特異性引物為FR447和FF463-486,引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。特異性引物FR447的序列為3’ACGTAGTGGAAATGAGCAACA5’; FF463-486的序列為3’CACAACCGTTATTAACATGCG5’。

3.3 引物的種特異性

通過(guò)凝膠成像分析儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果(圖2)顯示:僅番石榴實(shí)蠅在約645 bp位置擴(kuò)增出1條清晰、單一的目標(biāo)條帶,其它的19種供試實(shí)蠅種類(lèi)均未出現(xiàn)目標(biāo)條帶。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,檢測(cè)所獲得的目標(biāo)條帶均一致,表明該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的種特異性引物FR447和FF463-486具有較強(qiáng)的特異性及穩(wěn)定性。

將本實(shí)驗(yàn)所得到的PCR產(chǎn)物送到上海英濰捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序,將測(cè)序所得序列提交給數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)進(jìn)行BLAST,結(jié)果表明本檢測(cè)所得的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的番石榴實(shí)蠅序列具有100%的一致性。

M:100 bp DNA Ladder；1:番石榴實(shí)蠅;2:楊桃實(shí)蠅;3:辣椒實(shí)蠅;4:桔小實(shí)蠅;5:具條實(shí)蠅;6:銹實(shí)蠅;7:腿端黑實(shí)蠅;8:南瓜實(shí)蠅;9:瓜實(shí)蠅;10:瘤脛實(shí)蠅;11:黑膝實(shí)蠅;12:何氏華實(shí)蠅;13:棗實(shí)蠅;14:顏帶實(shí)蠅;15:近黑顏實(shí)蠅;16:五指山實(shí)蠅;17:滇寡鬃實(shí)蠅;18:瑞麗果實(shí)蠅;19:黑顏實(shí)蠅;20:瓜棍腹實(shí)蠅;21:空白對(duì)照(ddH2O)。

圖2 引物FR447和FF463的種特異性驗(yàn)證結(jié)果

3.4 引物的靈敏度

采用核酸蛋白分析儀測(cè)試提取的番石榴實(shí)蠅DNA模板的濃度為55.97 ng/μL。取不同濃度的DNA模板測(cè)定最低檢出閾值,結(jié)果(圖3)表明:隨著模板濃度的降低,所擴(kuò)增出的條帶逐漸減弱,在稀釋10-1倍后仍有明顯的條帶,進(jìn)一步說(shuō)明該SS-PCR方法具有較高的靈敏度。

M:100 bp DNA Ladder；1～19:番石榴實(shí)蠅；20:空白對(duì)照(ddH2O)。圖3 SS-PCR快速鑒定番石榴實(shí)蠅的應(yīng)用與驗(yàn)證結(jié)果

3.5 SS-PCR快速鑒定番石榴實(shí)蠅的應(yīng)用與驗(yàn)證

對(duì)截獲的19份供試實(shí)蠅標(biāo)本的蟲(chóng)樣進(jìn)行檢測(cè)與驗(yàn)證,結(jié)果(圖4)均發(fā)現(xiàn)了目標(biāo)條帶,表明采用SS-PCR方法的鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致,該方法具有較好的穩(wěn)定性,可以應(yīng)用于檢疫和監(jiān)測(cè)中所獲得的番石榴實(shí)蠅的鑒定工作。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)選用mt DNA COⅠ作為標(biāo)記基因[10],篩選設(shè)計(jì)番石榴實(shí)蠅的種特異性引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,僅番石榴實(shí)蠅能特異并穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出長(zhǎng)度約645 bp的清晰、單一的目標(biāo)條帶,其它實(shí)蠅種類(lèi)均無(wú)目標(biāo)條帶出現(xiàn),進(jìn)一步驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)引物的特異性。然而當(dāng)口岸僅發(fā)現(xiàn)卵或殘?bào)w時(shí),即只能提取到微量DNA時(shí),SS-PCR檢測(cè)鑒定方法的靈敏度就至關(guān)重要了。本實(shí)驗(yàn)所建立的方法具有較高的靈敏度,能檢測(cè)到的DNA模板濃度可低至5.597ng/μL。同時(shí),該SS-PCR檢測(cè)鑒定方法在實(shí)際檢疫工作中也得到了應(yīng)用和驗(yàn)證。

M:100 bp DNA Ladder；1:稀釋100倍；2:稀釋10-1倍； 3:稀釋10-2倍；4:稀釋10-3倍；5:空白對(duì)照(ddH2O)。圖4 引物GF85和GR531的靈敏度驗(yàn)證結(jié)果

綜上所述,本文所建立的SS-PCR快速鑒定番石榴實(shí)蠅的方法,提供了一種靈敏的番石榴實(shí)蠅特異性檢測(cè)引物,其能夠檢測(cè)各個(gè)齡期、各個(gè)蟲(chóng)態(tài)、多種組織狀態(tài)的番石榴實(shí)蠅，并且能區(qū)分近緣種、屬。本方法可以在8 h之內(nèi)完成對(duì)番石榴實(shí)蠅的鑒定,具有快速簡(jiǎn)便、特異性高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),能夠滿(mǎn)足口岸水果蔬菜檢疫快速通關(guān)的要求。