章琳俐,李 麗,辛清武,朱志明,繆中緯,鄭嫩珠

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,福建 福州 350013)

抗氧化系統(tǒng)是動物機體重要的保護系統(tǒng),防止細胞免受自由基和活性氧等的攻擊。抗氧化系統(tǒng)失衡可引起組織的自由基累積,造成脂質(zhì)過氧化、細胞膜和DNA損傷等一系列氧化損傷[1]。在畜禽生產(chǎn)上抗氧化系統(tǒng)失衡可導(dǎo)致動物對運輸或運動過程的應(yīng)激易感,使宰后組織氧化損傷、肉質(zhì)下降,甚至病理損傷[2-5]。了解家禽組織的抗氧化特性及相關(guān)基因表達的分子機制,對于探索減少生產(chǎn)中各種應(yīng)激的不良影響的方法具有重要意義。

抗氧化酶是抗氧化系統(tǒng)的重要組成成員,是清除自由基和活性氧的第一道防線。其中,谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px/GPx)是重要的抗氧化酶之一,GSH-Px可通過催化還原作用清除自由基代償產(chǎn)物過氧化氫及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,防止其對組織的損傷[6]。有關(guān)研究結(jié)果顯示不同物種和組織間GSH-Px的活性和基因表達水平不同[7,8]。目前關(guān)于GSH-Px基因表達和酶活性在多個物種中已有研究報道,但在鴨上的研究報道較少[7-9]。了解抗氧化酶的組織分布特性,對于探索預(yù)防家鴨生產(chǎn)中各種應(yīng)激的不良影響的方法具有重要意義。

半番鴨是繼北京鴨、番鴨后極具發(fā)展?jié)摿Φ娜庥米续?具有瘦肉率高、脂肪少、耐粗飼、抗病力強等特點,也是生產(chǎn)肥肝和羽毛的重要來源,成為水禽肉用品種改良研究的熱點之一[10]。目前,關(guān)于半番鴨抗氧化特性的研究報道較少,少數(shù)報道也僅針對血液或單一組織[11,12]。了解半番鴨不同組織的抗氧化水平可為半番鴨對環(huán)境因子(如應(yīng)激)響應(yīng)能力的研究提供理論參考,在科研和生產(chǎn)上都具有一定的生物學(xué)意義。因此,本研究通過測定半番鴨不同組織GSH-Px基因表達水平和酶活力,探索了半番鴨不同組織的抗氧化特性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗鴨來源于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動物養(yǎng)殖試驗基地,按常規(guī)操作程序進行飼養(yǎng)管理,飼料由福建華龍集團飼料有限公司提供,自由采食和飲水,在不同生長時期的飼料營養(yǎng)水平見表1。在70日齡時隨機選取5只同批次健康的半番鴨,頸動脈放血處死后,采集其組織(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌胃和胸肌)樣品,立即投入液氮中,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗鴨飼料的營養(yǎng)水平

1.2 GSH-Px基因表達的qRT-PCR檢測和分析

各組織經(jīng)勻漿提取總RNA (Trizol法),檢測RNA含量、純度;調(diào)整總RNA濃度至1 μg/μL,后轉(zhuǎn)錄成cDNA (Super ScriptTMⅢ First-Strand Synthesis Super反轉(zhuǎn)試劑盒, Invitrogen,美國),于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

引物根據(jù)Gen Bank已公布的鴨GSH-Px和β-actin基因序列應(yīng)用Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8軟件進行設(shè)計,由生工生物工程上海股份有限公司合成,引物序列見表2。以β-actin基因為內(nèi)參,采用CFX384多重實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad,美國)檢測半番鴨各組織的GSH-Px mRNA表達情況,每個樣品重復(fù)檢測5次。反應(yīng)體系(20 μL)見表3,反應(yīng)條件:95 ℃ 1 min;40個循環(huán)(95 ℃ 15 s,63 ℃ 25 s,收集熒光)；從55 ℃至95 ℃，進行溶解曲線分析。采用2-ΔΔCt值方法來計算mRNA的相對表達量。

表2 熒光定量PCR引物的信息

表3 定量PCR反應(yīng)體系

1.3 抗氧化酶活力測定

提取蛋白,用考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒測定濃度后,用組織谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒測定GSH-Px的活力,操作步驟按照試劑說明書進行。所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。GSH-Px活力測定采用化學(xué)比色法,1個酶活力單位(U/mg)表示在扣除非酶促反應(yīng)引起的還原型谷胱甘肽(GSH)減少的部分后每分鐘每毫克組織蛋白反應(yīng)體系中GSH濃度減少1 μmol/L。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0軟件對不同組織mRNA相對表達量和抗氧化酶活力進行描述性數(shù)據(jù)統(tǒng)計、多重比較、顯著性檢驗及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 半番鴨GSH-Px基因的qRT-PCR檢測

半番鴨各組織GSH-Px和β-actin基因的qRT-PCR檢測結(jié)果見圖1。如圖1所示，目的基因和β-actin的擴增曲線均呈“S”形,基線平緩,溶解曲線單峰,表明基因的動力學(xué)曲線整體平行性較好,擴增產(chǎn)物單一,未見引物二聚體和非特異性擴增產(chǎn)物。

上圖為GSH-Px基因；下圖為β-actin基因。圖1 qRT-PCR擴增曲線和溶解曲線

2.2 GSH-Px mRNA的組織表達特點

qRT-PCR結(jié)果顯示,GSH-Px mRNA在半番鴨各組織(肌胃、心臟、肝臟、脾臟、肝臟、肺臟、胸肌和腎臟)中均有表達,但組織間表達差異顯著(圖2)。其中腎臟GSH-Px mRNA的表達量最高,胸肌次之,肌胃表達量最低,腎臟表達量是肌胃的45倍。GSH-Px mRNA相對表達水平的總體情況為:腎臟>胸肌>肺臟>脾臟>肝臟>心臟>肌胃。

1:肌胃;2:心臟;3:肝臟;4:脾臟;5:肺臟;6:胸肌;7:腎臟。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。內(nèi)參基因為β-actin;n=5。

圖2 半番鴨組織GSH-Px mRNA的相對表達水平

2.3 半番鴨組織的GSH-Px活力檢測結(jié)果

選取了基因表達水平具有代表性的肝臟、胸肌、腎臟和肌胃,檢測各組織的GSH-Px活力，結(jié)果如表4所示。結(jié)果顯示：胸肌和肝臟的GSH-Px活力顯著高于腎臟和肌胃的(P<0.01);肌胃的酶活力最低；各組織GSH-Px活力的總體情況為胸肌>肝臟>腎臟>肌胃。

表4 半番鴨不同組織的GSH-Px活力 U/mg

注:同列數(shù)據(jù)后附不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.4 GSH-Px mRNA表達水平與酶活力的相關(guān)性

利用SPSS 17.0軟件對組織GSH-Px活力與mRNA表達水平間的相關(guān)性進行分析,結(jié)果(表5)顯示,除胸肌兩者的相關(guān)性達到顯著水平(P<0.05)外,在其余組織中均未存在顯著相關(guān)關(guān)系。但從總體上來看,胸肌、肝臟和腎臟的兩個指標均高于肌胃,胸肌的GSH-Px活力與mRNA表達水平都較高,肌胃兩者都較低。

表5 各組織GSH-Px活力與mRNA表達水平間的相關(guān)系數(shù)

注:“*”表示相關(guān)性達顯著(P<0.05)水平。

3 討論

谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是動物機體中重要的抗氧化酶,不僅在維持細胞氧化還原狀態(tài)的平衡中發(fā)揮重要作用,并可影響細胞代謝和應(yīng)激抵抗能力[13]。GSH-Px也可對一些重要的生理活動產(chǎn)生影響,如分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、前炎性因子和類花生酸類物質(zhì)的產(chǎn)生[14]。在禽類大多數(shù)組織器官中均發(fā)現(xiàn)有GSH-Px的存在。Surai[15]報道了雞胚胎時期不同組織GSH-Px活性的變化和新生雛雞不同組織間酶活性的特征。Tan等[16]的研究結(jié)果顯示雞肝臟GSH-Px的活力與熱應(yīng)激有關(guān)。

本研究中半番鴨GSH-Px mRNA廣泛表達于不同組織器官,但組織間表達差異明顯，總體趨勢為腎臟>胸肌>肺臟>脾臟>肝臟>心臟>肌胃。與火雞上的報道類似,半番鴨腎臟GSH-Px mRNA的表達水平最高;但與之不同的是半番鴨胸肌組織也具有較高的GSH-Px mRNA表達水平,而火雞胸肌的GSH-Px mRNA表達水平最低[17]。Xu等[18]對豬的研究結(jié)果顯示GSH-Px mRNA表達水平表現(xiàn)為肌肉>腎臟>肝臟,而猩猩GSH-Px mRNA在肝臟、腎臟中表達較高。不同物種組織間GSH-Px mRNA表達顯示出較大的差異和不同的組織分布規(guī)律,說明抗氧化酶基因表達具有物種和組織特性。

半番鴨胸肌和肝臟的GSH-Px活力較高,腎臟次之,肌胃最低。Sunde等[17]報道的火雞各組織器官GSH-Px活力為腎臟>肌胃>肝臟>胸肌。Toshiro等[19]的報道顯示35日齡雞的GSH-Px活力在肝臟中最高,在腎臟中次之,在胸肌中最低。與雞和火雞胸肌低GSH-Px活力不同,半番鴨胸肌顯示出較高的GSH-Px活力。Daun等[9]對雞、火雞、鴨、鴕鳥和羊肌肉的GSH-Px活力進行比較后,也發(fā)現(xiàn)鴨肌肉的GSH-Px活力顯著高于其它動物。半番鴨胸肌較高的GSH-Px活力提示其胸肌組織相對于其它組織或其它物種肌肉組織可能具有更高的抗氧化能力，這可能與鴨鵝等水禽胸肌發(fā)達有關(guān),半番鴨的胸肌率可達16%以上[14],而雞的胸肌率在9.5%左右[16]。一些研究表明骨骼肌收縮產(chǎn)生的活性氧不僅可使骨骼肌氧化應(yīng)激水平升高,同時也能提高其自身的抗氧化防御水平[20]。鴨的肌肉組織或許是研究肌肉抗氧化和肉品質(zhì)調(diào)控的模型。

本研究中半番鴨組織GSH-Px活力與mRNA表達水平的變化不完全一致,可能是由于抗氧化酶基因表達受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控影響[21],另一方面抗氧化酶活力也會受底物水平等因素的影響,因此抗氧化酶mRNA表達水平與其活力不總是呈現(xiàn)簡單的相關(guān)性[22,23]。但從總體上來看,半番鴨代謝相對活躍的組織(肝臟、腎臟和胸肌)酶活力和mRNA表達水平均較高,而肌胃的兩個指標均較低,這可能與酶生理功能及組織代謝水平有關(guān)。肝臟是動物物質(zhì)、能量代謝的重要器官,腎臟是禽類重要排泄器官,胸肌則是水禽重要的運動器官,都具有較高的代謝水平,需要維持較強的抗氧化能力和水平。

4 結(jié)論

半番鴨GSH-Px基因表達和酶活力具有組織特異性。不同組織的GSH-Px活力差異可能與酶自身的生理功能以及組織代謝水平有關(guān)。半番鴨胸肌較高的GSH-Px酶活力和mRNA表達水平提示半番鴨胸肌具有較高的抗氧化能力。