束紅梅,何曉蘭,崔曉霞,倪萬(wàn)潮,郭書(shū)巧

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，江蘇 南京 210014)

栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim.)是葫蘆科栝樓屬多年生宿根攀援草本植物。近年來(lái)，栝樓用途不斷被開(kāi)發(fā)，除了作為中藥材外，其種子被開(kāi)發(fā)為休閑保健食用栝樓籽、栝樓油等。栝樓雌雄異株，雌株以收栝樓籽為主，雄株以收獲根為主。因此，在生產(chǎn)中因種植目的不同，雌雄株種植比例存在差異。目前，生產(chǎn)中栝樓繁殖主要通過(guò)根莖營(yíng)養(yǎng)繁殖控制植株性別，存在繁殖系數(shù)低、耗費(fèi)大量根莖(天花粉原材料)、種苗價(jià)格貴、易攜帶病毒等問(wèn)題。為提高栝樓的種植面積和效益，用種子繁殖是一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用的方法，但研究認(rèn)為種子繁殖時(shí)雌株只占10%～30%，雌雄株比例嚴(yán)重失調(diào)且無(wú)法控制[1]。因此若能明確雌雄栝樓苗期差異及其性別形成機(jī)制，可為通過(guò)種子繁育培育優(yōu)質(zhì)栝樓提供鑒定方法。因此，本文主要綜述了雌雄栝樓形態(tài)、生理、多態(tài)性標(biāo)記等方面的差異，以及其他雌雄異株植物性別決定機(jī)制的研究進(jìn)展，為研究和鑒定栝樓雌雄植株差異提供參考依據(jù)。

1 雌雄栝樓的差異

1.1 雌雄栝樓的形態(tài)差異

目前，對(duì)雌雄栝樓形態(tài)方面的研究表明，苗期雌雄栝樓植株形態(tài)無(wú)明顯差異，直到開(kāi)花期雌雄栝樓在花器官上表現(xiàn)出明顯差異。栝樓花為雌雄異株，僅有雌花、雄花2種花性別分化，其形態(tài)、分化時(shí)期存在差異[2]。栝樓雄花為單性花[2]，包括花托、花萼、花瓣、雄蕊，分化階段包括雄花花芽未分化期、花芽分化初期、花序分化期、花萼原基分化期、花瓣原基分化期及雄蕊原基分化期共6個(gè)時(shí)期，在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中僅見(jiàn)雄蕊原基的分化及生長(zhǎng)。栝樓雌花為兩性花[2]，包括花托、花萼、花瓣、子房、柱頭、花柱、退化雄蕊，分化階段包括花芽未分化期、花芽花序分化期、萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期、雌蕊原基分化期及雄蕊原基退化期共7個(gè)時(shí)期，在整個(gè)發(fā)育期存在雌蕊和雄蕊的共同發(fā)育階段，但是隨后雄蕊發(fā)育失敗。

1.2 雌雄栝樓的生理差異

為了解雌雄栝樓的生理差異，前人利用多種檢測(cè)方法比較了栝樓雌雄植株的多個(gè)生理指標(biāo)，包括植物激素、多胺、可溶性糖、光合色素、內(nèi)源保護(hù)酶等，發(fā)現(xiàn)雌雄植株的這些生理指標(biāo)存在差異。郭曉亮[3]研究發(fā)現(xiàn)，雄性栝樓幼苗葉片中水溶性酚類(lèi)物質(zhì)、光合色素、可溶性糖、葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素等含量均顯著高于雌性，而雌性栝樓葉片中還原糖含量則高于雄性植株。李珊等[4]以幼嫩栝樓葉片為材料研究發(fā)現(xiàn)，雄株的光合色素、可溶性蛋白質(zhì)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)酶活性均高于雌株，而雌株的丙二醛(MDA)、可溶性糖含量高于雄株。曲超等[5]研究發(fā)現(xiàn)，苗期栝樓雄株葉片中水溶性酚含量顯著高于雌株，而雌株葉片中可溶性糖、脫落酸(ABA)和玉米素核苷(ZR)的含量均顯著高于雄株。劉蕓等[6]對(duì)不同生長(zhǎng)階段的栝樓葉片激素含量的分析發(fā)現(xiàn)，在檢測(cè)的各生長(zhǎng)階段，雄株中脫落酸含量均高于雌株，而雌株栝樓吲哚乙酸含量高于雄性植株；但玉米素核苷、赤霉素在栝樓不同生長(zhǎng)階段表現(xiàn)不太一致，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，其在雄株中的含量高于雌株；進(jìn)入生殖期后，雄株中玉米素核苷、赤霉素含量下降。同時(shí)劉蕓等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，雄株栝樓葉片的光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和水分利用效率均大于雌株；雄株比雌株提前進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段，當(dāng)雄株進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段后，其光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度均大于雌株，但水分利用效率略小于雌株；當(dāng)雌株進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段后，其蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度大于雄株，而光合速率和水分利用效率顯著小于雄株。

綜合比較前人的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雌雄栝樓存在生理差異，但是在不同時(shí)期不同研究中同一指標(biāo)在雌雄株間的結(jié)果不太一致，這也說(shuō)明單純依靠生理指標(biāo)來(lái)比較栝樓雌雄株差異受到多種因素的影響。所以普遍認(rèn)為不能通過(guò)生理指標(biāo)的差異來(lái)準(zhǔn)確鑒定出雌雄栝樓植株。

1.3 雌雄栝樓的多態(tài)性標(biāo)記研究

前期研究人員通過(guò)比較栝樓雌雄株的過(guò)氧化物酶、多酚氧化酶同工酶活性及條帶差異來(lái)研究雌雄栝樓差異。于鳳池等[8]研究發(fā)現(xiàn)，栝樓雌株葉片的過(guò)氧化物同工酶活性高于雄株，且雌株葉片中有一條特異性的過(guò)氧化物酶同工酶譜帶；孫永剛[9]在栝樓葉片中得到4條與性別相關(guān)的過(guò)氧化物氧化酶譜帶，其中3條是與雌株相關(guān)的多酚氧化酶條帶。

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)研究人員利用多種標(biāo)記方法鑒定到一些與栝樓性別相關(guān)的多態(tài)性標(biāo)記。孫永剛[9]檢測(cè)到71個(gè)AFLP多態(tài)性標(biāo)記，其中40條來(lái)自雌株、31條來(lái)自雄株。曲益濤等[10]利用RAPD體系得到1條600 bp雄株特異條帶，并將其轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。但其他實(shí)驗(yàn)室[11]未能通過(guò)此標(biāo)記有效鑒定出栝樓雌雄植株。Nanda等[12]利用ISSR引物在雄性野蛇瓜(TrichosanthesdioicaRoxb.)中得到一條720 bp特異條帶。

由此可以看出，雖然研究人員通過(guò)不同方法對(duì)栝樓雌雄植株的多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行了研究，但目前尚未得到有效穩(wěn)定地區(qū)分苗期雌雄栝樓的標(biāo)記。說(shuō)明目前所獲得的標(biāo)記具有一定的局限性。

2 雌雄異株植物性別決定機(jī)制

植物的性別決定不同于動(dòng)物，其具有不穩(wěn)定性和多樣性的特點(diǎn)。近年來(lái)，隨著遺傳學(xué)和基因組學(xué)的快速發(fā)展，在植物性別研究方面取得了一些進(jìn)展，主要集中在性染色體、性別決定基因、激素調(diào)控3個(gè)方面。

2.1 雌雄異株植物性染色體的類(lèi)型

在有花植物中，雌雄異株植物僅占6%[13]，而且僅在少部分雌雄異株植物中發(fā)現(xiàn)性染色體[14]，一般分為同型性染色體(XX與ZZ)和異型性染色體(XY與ZW)2種類(lèi)型，最為常見(jiàn)的是XY型[13,15-16]。

植物性染色體是由1對(duì)常染色體進(jìn)化而來(lái)，而且植物性染色體的發(fā)育包括幾個(gè)階段[13]。進(jìn)化初期的性染色體與常染色體無(wú)法從形態(tài)上區(qū)分,這類(lèi)性染色體至少在20個(gè)被子植物中存在,如弗吉尼亞草莓、蘆筍和番木瓜等[17]。在進(jìn)化過(guò)程中,性染色體逐漸形成自身的形態(tài)特征,演變成異型的性染色體,主要表現(xiàn)為X(Z)與Y(W)染色體之間以及性染色體與常染色體之間長(zhǎng)度上的差異。性染色體進(jìn)化的一個(gè)主要階段就是重復(fù)序列的累積，異染色質(zhì)的觸發(fā)和重組抑制現(xiàn)象的出現(xiàn)致使性染色體結(jié)構(gòu)和形態(tài)發(fā)生分化，從而引發(fā)Y染色體退化以及X染色體劑量補(bǔ)償效應(yīng)，最終導(dǎo)致性染色體的進(jìn)化[13,15]。

目前，具有性染色體的植物較少，這可能與多數(shù)雌雄異株植物進(jìn)化時(shí)間較短有關(guān)，許多雌雄異株植物性染色體于相對(duì)近期形成。但是，研究人員認(rèn)為所有的雌雄異株植物都具有進(jìn)化出性染色體的潛能[13]。栝樓作為雌雄異株植物，其是否存在性染色體？有人對(duì)栝樓屬大苞栝樓(Trichosanthesbracteata)的染色體進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其不存在性染色體[18]，雌雄大苞栝樓的染色體核型一致。栝樓是否也跟這個(gè)同屬植物相似而不存在性染色體，有待進(jìn)一步研究。

2.2 雌雄異株植物性別決定基因的鑒定

植物性別由性染色體決定，但是性染色體上大部分基因并不直接參與性別決定，個(gè)體分化為雌性還是雄性依賴(lài)于性別決定區(qū)域的關(guān)鍵基因[13]。性別決定基因是決定雌雄異株植物性別形成的關(guān)鍵因子，對(duì)于含有性染色體的植物，性別決定基因位于性染色體上[19]。目前，關(guān)于性別決定基因的研究主要集中在對(duì)性染色體連鎖基因以及花器官發(fā)育相關(guān)基因的克隆與功能鑒定上。從性染色體連鎖基因入手，挖掘雌雄性器官特異表達(dá)的基因，是鑒定性別決定基因普遍采用的方法。研究表明典型的雌雄異株植物菠菜、蘆筍的性別決定基因已定位到相應(yīng)的連鎖群[20-21]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近期對(duì)性別決定基因的鑒定主要通過(guò)基因組、轉(zhuǎn)錄組等高通量測(cè)序方法來(lái)篩選目的基因。Jia等[22]通過(guò)基因組測(cè)序、重測(cè)序及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)Υ菩郛愔旯麡?shù)楊梅進(jìn)行比較，在8號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)一段59 kb的雌性特異區(qū)域，該區(qū)域包含7個(gè)預(yù)測(cè)基因，其中4個(gè)可能與雌雄花性別決定相關(guān)。Akagi等[23-25]通過(guò)基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析了雌雄異株的柿屬二倍體種君遷子、六倍體栽培柿、彌核桃，鑒定出這3種植物的雌雄決定基因。在君遷子(Diospyroslotus)Y染色體上鑒定出性別決定基因OGI[25]；在六倍體栽培柿(Diospyroskaki)中發(fā)現(xiàn)性染色體上OGI基因和常染色體上的MeGI基因協(xié)同調(diào)控柿雌雄發(fā)育[23]；在獼猴桃Y染色體上鑒定到的性別相關(guān)基因是一個(gè)細(xì)胞分裂素響應(yīng)調(diào)節(jié)基因SyGI[24]。這些性別決定基因通過(guò)不同的作用機(jī)制來(lái)調(diào)控雌雄性別的形成。

2.3 雌雄異株植物性別的激素調(diào)控研究

一般認(rèn)為，植物性別受成花物質(zhì)的形成和積累支配，激素對(duì)性別的調(diào)控主要是通過(guò)激素調(diào)控成花物質(zhì)的水平而引起性別的改變[26]。研究表明[26-27]，內(nèi)源激素、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的含量和(或)比率與性別分化存在一定的聯(lián)系。相同激素在不同植物性別分化的調(diào)控作用不盡相同，有時(shí)甚至是相反的[26]。黃瓜中生長(zhǎng)素和赤霉素對(duì)花發(fā)育的影響是間接的[26]，它們分別增加或減少了內(nèi)源乙烯的含量，而高水平的乙烯含量會(huì)促使心皮發(fā)育、抑制雄蕊發(fā)育；玉米中給雄穗添加赤霉素可使雄穗變?yōu)榇菩裕膬?nèi)源赤霉素會(huì)使雌穗變?yōu)樾鬯隱28]。而且在某些植物中，雌雄性別決定基因是植物激素生物合成相關(guān)基因。在雌雄同株的玉米中克隆出了2個(gè)性別決定基因分別影響油菜素內(nèi)酯和茉莉酸的生物合成[28-30]；在黃瓜中分離到2個(gè)控制性別的基因分別是乙烯生物合成相關(guān)基因CS-ACS2和CS-ACS1G[31];在甜瓜中，克隆到1個(gè)性別決定基因是乙烯生物合成相關(guān)基因CmACS-7[32]。

由此可以看出，激素以及激素合成相關(guān)基因在植物性別形成中起著重要作用，但是目前關(guān)于激素對(duì)植物性別調(diào)控的研究主要集中在雌雄同株植物，尚未有激素對(duì)雌雄異株植物調(diào)控的研究。

3 栝樓性別鑒定及調(diào)控的研究展望

從雌雄栝樓的形態(tài)、生理、多態(tài)性標(biāo)記的研究可以看出，目前尚未有切實(shí)可行的方法在苗期鑒定栝樓雌雄株?；谄渌菩郛愔曛参镄詣e決定機(jī)制的研究情況，對(duì)后續(xù)栝樓的性別鑒定以及調(diào)控研究提出以下建議：(1)對(duì)栝樓雌雄株不同生長(zhǎng)時(shí)期植株形態(tài)、染色體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，明確雌雄栝樓的形態(tài)特征及是否存性染色體。(2)對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期栝樓雌雄株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選出雌雄栝樓的差異基因及代謝途徑。并利用ISSR分子標(biāo)記構(gòu)建栝樓雌雄植株的DNA指紋圖譜，尋找與性別相關(guān)的分子標(biāo)記。明確與栝樓雌雄性別相關(guān)的基因和多態(tài)性位點(diǎn)。(3)對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期栝樓雌雄株的激素含量、生長(zhǎng)物質(zhì)測(cè)定分析雌雄栝樓的生理差異。并分析外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)栝樓雌雄比例的影響，尋找栝樓雌雄株的激素代謝差異及調(diào)控栝樓雌雄比例的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。