于江淼，王家林，張海粟

(青島科技大學(xué) 海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東 青島 266031)

當(dāng)前，在我國乃至世界上“三高”疾病已不足為奇，且大多數(shù)“三高”患者需要終身依靠藥物來控制病情，這不僅給病人在身體上帶來傷害，而且在經(jīng)濟(jì)上也是沉重的負(fù)擔(dān)。在這種大環(huán)境下，一種可以緩解、控制病情，且不會產(chǎn)生副作用的非藥物保健食品可以說是迫切需要的。納豆是一種傳統(tǒng)的發(fā)酵保健食品，由煮熟的大豆接種納豆菌發(fā)酵制得[1]。納豆含有多種生理活性物質(zhì)，起到良好的擴(kuò)張血管、溶解血栓的功效。其內(nèi)特有的納豆激酶是納豆菌分泌的具有溶栓作用的一種絲氨酸蛋白酶，具有高效溶解血栓的作用，近年來受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[2]。目前我國納豆的研發(fā)生產(chǎn)還處于初級階段，多以黃豆為原料且市場小，還需要認(rèn)真攻關(guān)關(guān)鍵技術(shù)，完善生產(chǎn)工藝，并不斷加大宣傳，開拓市場。

黑豆相對于黃豆、大豆更具營養(yǎng)價值，本身含多種天然色素、皂苷、大豆球蛋白、亞油酸、亞麻酸和多種活性物質(zhì)，更有養(yǎng)血平肝、補(bǔ)腎等藥用價值[3]。本文以黑豆為原料，對其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步改善納豆口味，獲得高活性納豆激酶的黑納豆生產(chǎn)工藝條件。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

1.1.1 原料

黑豆：購自山東省青島市四方利群集團(tuán)股份有限公司；納豆芽孢桿菌(BN-3-1)：篩選自日本濱梨納豆。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

試劑：纖維蛋白原和凝血酶，購于Sigma公司；尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品，購于北京索萊寶科技有限公司；其他藥品均為國產(chǎn)分析純。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，氯化鈉1%，pH 7.0～7.2。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

高精密電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌器 浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；潔凈工作臺 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；移液槍 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司；高轉(zhuǎn)速離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司；精密恒溫水浴槽 杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 納豆菌生長曲線的測定

本試驗(yàn)采用比濁法測定納豆菌生長曲線，取實(shí)驗(yàn)室保藏的菌種進(jìn)行活化，每隔3 h利用分光光度計(jì)測定二次活化后的納豆菌液的光密度，測到第36 h為止，利用光密度值可知菌液濃度[4]。將測得的光密度值(OD660)與所對應(yīng)的時間作圖，可繪出納豆菌的生長曲線，取對數(shù)生長期的菌液進(jìn)行接種。

2.2 黑納豆的制備工藝流程

精選黑豆→清洗→浸泡→蒸煮→接種→適當(dāng)條件下發(fā)酵→冰箱中后熟→納豆成品。

稱取20 g優(yōu)質(zhì)黑豆，用清水清洗兩三遍，除去黑豆表面雜質(zhì)，加入60 mL去離子水，浸泡黑豆。將浸泡好的黑豆瀝干水分，放進(jìn)121 ℃高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)蒸煮一定時間。煮熟的黑豆先進(jìn)行冷卻，冷卻到70 ℃左右接種一定量的納豆菌，攪拌均勻以保證豆子表面均勻沾滿菌液。接種納豆菌后的黑豆放入設(shè)定溫度的恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵一定時間[5]。將發(fā)酵好的黑豆進(jìn)行冷藏，后熟7～8 h，即可得到成熟的納豆。

2.3 納豆激酶的提取

取發(fā)酵完成的黑納豆，每份各2 g,加入2倍質(zhì)量的無菌生理鹽水中搖床30 min，將浸提液倒入離心管中，重復(fù)操作1次后，合并提取液，在轉(zhuǎn)速為10000 r/min的離心機(jī)中離心10 min，收集上清液為納豆激酶粗酶液。將研細(xì)的硫酸銨按照室溫下20%的飽和度加入其中，混合均勻后置于4 ℃保存過夜，在轉(zhuǎn)速為10000 r/min的離心機(jī)中離心30 min，收集上清液加入室溫下飽和度70%的研細(xì)硫酸銨，混合均勻后再次在轉(zhuǎn)速為10000 r/min的離心機(jī)中離心10 min，收集沉淀，取200 μL 0.1 mol/L PBS緩沖液溶解，冷藏備用。

2.4 納豆激酶纖溶酶活的測定

本文采用魏嶸的方法測定納豆激酶酶活并進(jìn)行了一定改進(jìn)[6]。利用紫外分光光度法測定納豆激酶對模擬人體血栓的纖維蛋白的纖溶活力，并以尿激酶的纖溶活力作為標(biāo)準(zhǔn)。分別吸取10000 U/mL的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液30，60，90，120，150 μL于微量離心管中，再分別加入120，90，60，30，0 μL的無菌生理鹽水，配成濃度為2，4，6，8，10 U/μL的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按表1中所需試劑依次添加，反應(yīng)結(jié)束后分別于10000 r/min下離心20 min，收集上清液于280 nm下測定吸光度，以無菌去離子水調(diào)零，重復(fù)測定3次并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，詳細(xì)測定步驟見表1。

表1 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品及納豆激酶樣品纖溶活性測定方法Table 1 Methods for determination of fibrinolytic activity of urokinase standard samples and nattokinase samples

2.5 黑納豆發(fā)酵工藝的單因素試驗(yàn)研究

根據(jù)黑納豆發(fā)酵工藝的關(guān)鍵點(diǎn)設(shè)計(jì)浸泡時間、蒸煮時間、納豆菌接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間5個因素，討論其對納豆發(fā)酵工藝的影響，每種因素設(shè)置5個不同水平，每次只對一個因素進(jìn)行探究，其他因素嚴(yán)格控制統(tǒng)一[7]，不加說明的其他因素默認(rèn)均取5個水平的中值，具體見表2。

表2 單因素試驗(yàn)Table 2 The single-factor experiment

對制備所得的納豆進(jìn)行納豆激酶酶活測定和感官評價。參照尿激酶的酶活計(jì)算出納豆激酶的酶活，以測得的最高酶活為滿分值，其余酶活與其的比值乘以50，作為該納豆的最終酶活得分。感官評價選擇5個指標(biāo)：形狀、口感、氣味、粘液、拉絲。評分標(biāo)準(zhǔn)：滿分為50分，每項(xiàng)占10分，最差為0分，見表3[8,9]。其中測定拉絲長度時，先用干凈的玻璃棒將納豆攪拌均勻，然后將其挑起直至拉斷，記錄拉絲長度。

表3 納豆感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 3 The sensory evaluation criteria of natto

2.6 黑納豆發(fā)酵工藝的正交優(yōu)化研究

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選出對納豆發(fā)酵工藝影響最大的4個因素，分別為發(fā)酵時間、蒸煮時間、發(fā)酵溫度、接種量，并選出每種因素最優(yōu)的3個水平，中間水平為最優(yōu)，發(fā)酵的時間分別為18，21，24 h，大豆蒸煮的時間分別為30，40，50 min，選擇發(fā)酵溫度分別為37，39，41 ℃，納豆菌的接種量分別為3%、4%、5%，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，分為9次不同水平組合的試驗(yàn)，試驗(yàn)方案見表4。對發(fā)酵完成的納豆進(jìn)行納豆激酶纖溶活性測定和感官評價(見表3)，相關(guān)計(jì)算參照單因素試驗(yàn)的計(jì)算方法。

通過分析正交試驗(yàn)結(jié)果可以得到納豆發(fā)酵工藝的最優(yōu)條件，根據(jù)此條件進(jìn)行黑納豆的制作，并對優(yōu)化后的納豆進(jìn)行納豆激酶酶活測定和感官評價。

表4 正交試驗(yàn)方案Table 4 Orthogonal experimental scheme

3 結(jié)果與分析

3.1 納豆菌生長曲線

對活化后的納豆菌采用比濁法進(jìn)行生長曲線的測定，結(jié)果見圖1。

圖1 納豆芽孢桿菌生長曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus natto

觀察納豆芽孢桿菌BN-3-1的生長曲線，發(fā)現(xiàn)其基本符合微生物生長周期的4個階段，應(yīng)接種15 h的納豆菌，此時的納豆菌正處于對數(shù)生長期。0～6 h為BN-3-1的調(diào)整期，6～15 h為BN-3-1的對數(shù)生長期，15～24 h為穩(wěn)定期，并從24 h開始轉(zhuǎn)為衰亡期。因此，選取對數(shù)生長期的15 h作為BN-3-1的最適發(fā)酵種齡。

3.2 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

不同濃度的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)液在37 ℃條件下水解纖維蛋白形成小肽片段和氨基酸，用三氯乙酸終止反應(yīng)沉淀大分子蛋白，測定上清液的吸光度值，確定不同濃度尿激酶標(biāo)準(zhǔn)液的纖溶活性。以標(biāo)準(zhǔn)尿激酶纖溶酶活為橫坐標(biāo)，以△OD280為縱坐標(biāo)作圖，發(fā)現(xiàn)二者呈線性相關(guān)，其回歸方程為y=0.0104x-0.0017，R2=0.9964，尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve urokinase activity

3.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 浸泡時間試驗(yàn)分析

圖3 不同浸泡時間條件下的納豆激酶纖溶活性Fig.3 Nattokinase fibrinolytic activity under different soaking time conditions

由圖3可知，納豆激酶的纖溶活性隨著浸泡時間的增加呈現(xiàn)先緩慢升高再降低的趨勢，分別為(3796.15±76.92)，(4238.46±58.75)，(4411.54±101.76)，(3937.18±96.79)，(3834.62±38.46) U/mg，換算成百分制的分?jǐn)?shù)之后分別為39.47，44.07，45.87，40.94，39.87分。感官評價得分在趨勢上與纖溶酶活性較為一致，分別為26，30，37，36，30分。這可能是因?yàn)榻輹r間不充分，黑豆未充分吸水，未能完全溶解營養(yǎng)基質(zhì)以及營養(yǎng)物質(zhì)的輸送不到位，導(dǎo)致各部分傳質(zhì)不均勻的現(xiàn)象，拉絲物質(zhì)少且黏性較差，限制了納豆菌的生長繁殖[10]。當(dāng)浸泡時間過長時，大豆吸水膨脹，空隙變小，納豆菌發(fā)酵過程中得不到足夠的氧氣，也會影響納豆激酶的活性。通過對納豆激酶纖溶活性和感官的綜合分析，得出在其他影響因素不變的條件下，在水中浸泡時間為15 h時發(fā)酵的黑納豆最符合要求。

3.3.2 蒸煮時間試驗(yàn)分析

圖4 不同蒸煮時間條件下的納豆激酶酶活Fig.4 Nattokinase fibrinolytic activity under different cooking time conditions

由圖4可知，納豆激酶的纖溶活性隨著蒸煮時間的增加顯著升高后趨于平穩(wěn)，分別為(2578.21±58.75)，(4411.54±101.76)，(4744.87±135.07)，(4667.95±123.64)，(4642.31±101.76)U/mg，換算成分?jǐn)?shù)分別為26.81，45.87，49.33，48.53，48.27分，感官評價得分分別為26，37，38，29，25分。這可能是由于蒸煮時間延長，黑豆結(jié)構(gòu)更加疏松，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的溶出和菌種的生長[11]。但蒸煮時間過長會破壞黑豆的營養(yǎng)物質(zhì)，反而不利于納豆菌的生長繁殖，通過對納豆激酶纖溶活性和感官的綜合分析，同時考慮能耗問題，得出在其他影響因素不變的條件下，蒸煮時間為30 min時發(fā)酵的黑納豆最符合要求。

3.3.3 接種量試驗(yàn)分析

圖5 不同接種量條件下的納豆激酶酶活Fig.5 Nattokinase fibrinolytic activity under different inoculum amount conditions

由圖5可知，納豆激酶的纖溶活性隨著接種量的增加顯著升高后又緩緩下降，分別為(3411.54±66.62)，(4411.54±101.76)，(4642.31±135.07)，(4546.15±101.76)，(4488.46±44.41)U/mg，換算成分?jǐn)?shù)分別為35.47，45.87，48.28，47.06，46.47分，感官評價得分分別為21，24，37，38，26分。這可能是由于接種量較小，菌液不能均勻貼附在黑豆表面，需要較長時間繁殖積累，從而延長發(fā)酵時間，不易充分發(fā)酵；而接種量過大，納豆菌種會因?yàn)樯L過快消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致菌體缺氧，生長速度下降[12]。通過對納豆激酶纖溶活性和感官的綜合分析，得出在其他影響因素不變的條件下，接種量為3%時發(fā)酵的黑納豆最符合要求。

3.3.4 發(fā)酵溫度試驗(yàn)分析

圖6 不同發(fā)酵溫度條件下的納豆激酶酶活Fig.6 Nattokinase fibrinolytic activity under different fermentation temperatures conditions

由圖6可知，納豆激酶的纖溶活性隨著發(fā)酵溫度的增加顯著升高后趨于平穩(wěn)，分別為(1962.82±58.75)，(2821.79±44.41)，(4411.54±101.76)，(4539.74±117.50)，(4526.92±115.38)U/mg，換算成分?jǐn)?shù)為20.41，29.34，45.87，47.20，47.07分，感官評價最終得分為20，24，36，37，29分。在發(fā)酵過程中發(fā)酵溫度影響菌體的各種酶促反應(yīng)和蛋白質(zhì)的合成，物料和產(chǎn)物的物理性質(zhì)也隨之變化。開始隨著溫度的升高，可以使反應(yīng)速度增大，菌體生長速度增大，達(dá)到37 ℃后略有增加并趨于穩(wěn)定。發(fā)酵溫度達(dá)到41 ℃時，雖然纖溶酶活沒有顯著降低，但是從感官評價來看，黑豆表面暗沉，拉絲物質(zhì)明顯，粘度變低，長度明顯變小，可能是由于納豆發(fā)酵過程中物料中心的熱量無法散出，不利于菌體的生長[13]。通過對納豆激酶纖溶活性和感官的綜合分析，得出在其他影響因素不變的條件下，發(fā)酵溫度為39 ℃時發(fā)酵的黑納豆最符合要求。

3.3.5 發(fā)酵時間試驗(yàn)分析

由圖7可知，納豆激酶的纖溶活性隨著發(fā)酵時間的增加顯著增加后有一定回落，分別為(3616.67±88.82)，(4411.54±101.76)，(4629.49±80.06)，(4808.97±96.79)，(4706.41±117.50)U/mg，換算成分?jǐn)?shù)為37.60，45.87，48.13，50.00，48.93分，感官評價得分隨著發(fā)酵時間的推移，變化更為顯著，分別為25，36，37，32，28分。可能是由于發(fā)酵時間較短，微生物不能完全利用黑豆的營養(yǎng)物質(zhì)生長繁殖，而過長的發(fā)酵時間會造成納豆老化，降低觀感，同時納豆激酶活力降低[14]。通過對納豆激酶纖溶活性和感官的綜合分析得出在其他影響因素不變的條件下，發(fā)酵時間為21 h時發(fā)酵的黑納豆最符合要求。

圖7 不同發(fā)酵時間條件下的納豆激酶酶活Fig.7 Nattokinase fibrinolytic activity under different fermentation time conditions

3.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

3.4.1 正交試驗(yàn)分析

正交試驗(yàn)發(fā)酵的納豆所測得的納豆激酶纖溶活性及感官得分見表5。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of orthogonal experiment

正交試驗(yàn)分析見表6。

表6 正交試驗(yàn)分析Table 6 The orthogonal experimental analysis

續(xù) 表

對納豆發(fā)酵影響最大的4個因素及3個最優(yōu)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，由試驗(yàn)結(jié)果分析可知，不同條件對納豆發(fā)酵工藝的影響力大小結(jié)果為：發(fā)酵溫度>接種量>發(fā)酵時間>蒸煮時間，并且得到最優(yōu)的發(fā)酵條件為發(fā)酵時間18 h，蒸煮時間30 min，發(fā)酵溫度37 ℃，納豆菌接種量4%，浸泡時間15 h。

3.4.2 優(yōu)化納豆品質(zhì)分析

優(yōu)化前的黑納豆見圖8，優(yōu)化后的黑納豆見圖9。

圖8 未優(yōu)化的黑納豆Fig.8 The unoptimized black natto

圖9 優(yōu)化后的黑納豆Fig.9 The optimized black natto

由圖9可知，經(jīng)優(yōu)化后的黑納豆顆粒完整、飽滿、有光澤，拉絲物質(zhì)均勻附著在黑豆表面，攪動后拉絲長度可達(dá)到32 cm，不易斷裂?？诟熊浥淳d密，沒有氨味，與優(yōu)化前差異極大。

優(yōu)化后黑納豆的各項(xiàng)指標(biāo)見表7，通過直觀數(shù)據(jù)可知，優(yōu)化后黑納豆的納豆激酶纖溶活性和感官評價比單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)所發(fā)酵的納豆品質(zhì)高，說明該條件可作為黑納豆發(fā)酵工藝的最優(yōu)組合。

表7 優(yōu)化后黑納豆的各項(xiàng)指標(biāo)Table 7 The indicators of black natto after optimization

4 結(jié)論

本課題從原料入手對納豆這種保健食品進(jìn)行改良，以優(yōu)質(zhì)黑色大豆為原料，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對黑豆納豆的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終得出黑納豆的最適宜發(fā)酵條件為：在水中浸泡時間15 h、蒸煮時間30 min、納豆芽孢桿菌接種量4%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間18 h。優(yōu)化后黑納豆的外觀和口味都得到了一定的改良，并提取了較高的納豆激酶纖溶活性。

隨著社會經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展，物質(zhì)條件不斷豐富，人們對于衣、食、住、行等生活條件的要求與生活方式更趨于健康、綠色、環(huán)保，納豆特別是黑豆納豆將被越來越廣泛的人群所熟知與接受，擁有更加廣闊的市場與前景，將會變?yōu)槲覈＝∈称饭I(yè)方面新興的領(lǐng)軍產(chǎn)品[15]。本研究的目的在于改善納豆食品的質(zhì)量，加快納豆食品在中國市場的推廣，有效地降低我國“三高”人群的數(shù)量。