代劍峰，袁德水，張鴻景

（1.河北省林業(yè)和草原科學(xué)研究院，河北 石家莊050061；2.河北省林木良種工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊050061；3.河北省木蘭圍場(chǎng)國有林場(chǎng)，河北 圍場(chǎng)068450）

華北落葉松屬松科落葉松亞科落葉松屬植物，原產(chǎn)于河北、山西兩省，為我國特有樹種[1]。華北落葉松生長速度快、木材材質(zhì)好、用途廣、抗腐朽力強(qiáng)，是華北地區(qū)高山林帶的主要造林和生態(tài)樹種。華北落葉松育種主要是通過種子園來實(shí)現(xiàn)的，種子園在林木良種化的過程中發(fā)揮著重要作用[2]，不僅是提供大量優(yōu)質(zhì)種子的繁殖基地，本身又是由低級(jí)向高級(jí)發(fā)展的育種系統(tǒng)中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)[3]。位于河北省承德市圍場(chǎng)縣的龍頭山國有林場(chǎng)查字良種基地是現(xiàn)有的國家級(jí)落葉松良種基地之一，建有大面積的種子園，是河北省華北落葉松良種的主要來源。

種子園育種群體的遺傳多樣性和交配系統(tǒng)對(duì)種子園的長遠(yuǎn)發(fā)展具有重要意義。育種群體的遺傳多樣性影響著種子園良種的繁育能力和對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的適應(yīng)能力[4]，在良種選育過程中為了使種子園群體維持較寬的遺傳基礎(chǔ)，必須首先研究種子園的遺傳多樣性水平。另一方面，種子園交配系統(tǒng)不僅影響育種群體的遺傳變異水平[5-6]，同時(shí)還決定著后代基因型的空間分布和進(jìn)化潛能[7-10]，對(duì)種子園長遠(yuǎn)發(fā)展、種子產(chǎn)量和質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用。異交率和近交指數(shù)是交配系統(tǒng)的特征參數(shù)，直接反映了育種群體發(fā)生近交的概率，近交會(huì)導(dǎo)致雜合子比例下降、近交衰退和有效種群大小下降[11-12]，對(duì)種子園的育種效率產(chǎn)生不利影響。因此，在了解種子園各群體的遺傳多樣性水平的同時(shí)掌握種子園交配系統(tǒng)的實(shí)際情況，不僅對(duì)種子園的遺傳管理與經(jīng)營有著極其重要的生產(chǎn)實(shí)踐意義，而且對(duì)林木遺傳育種方法的選擇具有指導(dǎo)意義。

近年來在國內(nèi)針葉樹種中紅松、馬尾松和油松等都已相繼開展了天然林以及種子園遺傳多樣性和交配系統(tǒng)的研究[13-14]，而針對(duì)華北落葉松種子園交配系統(tǒng)的研究至今未見報(bào)道。隨著各種分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)交配系統(tǒng)的研究更加精確、方便，其中SSR分子標(biāo)記是目前應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)手段之一[15]。本文以圍場(chǎng)縣龍頭山國有林場(chǎng)查字良種基地的華北落葉松1.5代種子園37個(gè)無性系及其193個(gè)子代為樣本，利用9對(duì)SSR引物并結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法，分析了該種子園的遺傳多樣性和交配系統(tǒng)，為華北落葉松高世代種子園建設(shè)提供理論指導(dǎo)。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

取樣地點(diǎn)位于河北省承德市圍場(chǎng)縣龍頭山國有林場(chǎng)查字良種基地的華北落葉松1.5代種子園，以其中37個(gè)優(yōu)良無性系為親本群體，從子代林中隨機(jī)選擇這37個(gè)親本對(duì)應(yīng)的4~7個(gè)子代單株，共193株，作為子代群體，于2018年5月上旬取針葉樣本，置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取和SSR-PCR擴(kuò)增

采用CTAB法提取親本和子代群體總DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)濃度和質(zhì)量后-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

選用9對(duì)結(jié)果清晰的多態(tài)性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（表1），PCR采用25μL體系，其中2μl基因組DNA，12.5μL 2×Taq Mix（＋Dye），4μL 10μmol/L的上下游引物（上游引物加入M13標(biāo)簽）和0.5μL 1μmol/L M13修飾的熒光標(biāo)簽（M13-FAM、M13-HEX、M13-ROX和M13-TAMRA）。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃5min；94℃30s，65℃（-0.5℃每循環(huán)）45s，72℃1min（20個(gè)循環(huán)）；94℃30s，55℃45s，72℃1min（15個(gè)循環(huán)），72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物在ABI 3730XL DNA測(cè)序儀上進(jìn)行長度多態(tài)性檢測(cè)。

表1 引物信息

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用GeneMarker V2.4.0對(duì)檢測(cè)結(jié)果的峰圖進(jìn)行讀取，記錄等位基因信息，然后利用GenAlEx6.5估算親本和子代群體的遺傳多樣性參數(shù)，包括等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（He）、Shannon’s信息指數(shù)（I）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）和固定指數(shù)（F=1-Ho/He）[16]；采用MLTR 3.4軟件對(duì)交配系統(tǒng)參數(shù)進(jìn)行評(píng)估。采用最大期望值法，在95%的置信區(qū)間下經(jīng)過1000次重復(fù)取樣估算多位點(diǎn)異交率（tm）、單位點(diǎn)異交率（ts）、雙親近交系數(shù)（tm-ts）及單位點(diǎn)父本相關(guān)性（rp(s)）和多位點(diǎn)父本相關(guān)性（rp(m)）[17]等。

2 結(jié)果與分析

2.1 華北落葉松親本群體遺傳多樣性

親本群體37個(gè)無性系在9個(gè)SSR位點(diǎn)上的基因分型結(jié)果顯示（表2）：在親本群體中共檢測(cè)到93個(gè)等位基因（Na），平均每個(gè)位點(diǎn)10.33個(gè)，平均有效等位基因數(shù)（Ne）為5.137，其中LD75位點(diǎn)的Na和Ne最大，分別為15和9.447，LD06最小，分別為4和2.073；親本群體的Shannon’s多樣性指數(shù)（I）為1.795；觀測(cè)雜合度（Ho）的均值為0.346，小于期望雜合度（He）0.748，表明有雜合子缺失。圖1為引物L(fēng)D67在部分母本和子代中的擴(kuò)增結(jié)果。

2.2 華北落葉松子代群體遺傳多樣性

子代群體在9個(gè)SSR位點(diǎn)上的基因分型結(jié)果顯示（表3）：在子代群體中共檢測(cè)到127個(gè)等位基因（Na），平均每個(gè)位點(diǎn)14.11個(gè)，較親本群體高出3.78個(gè)；平均有效等位基因數(shù)（Ne）為6.075，較親本群體高出0.938個(gè)；子代群體的Shannon’s多樣性指數(shù)（I）為2.034，略高于親本，說明子代不僅保持了親本的遺傳多樣性，還受到了其他種子園親本基因流的影響；觀測(cè)雜合度（Ho）的均值為0.424，略高于親本群體，期望雜合度（He）的均值為0.791，與親本群體基本一致，表明子代群體中觀測(cè)到的雜合子比例有所上升，但依然存在雜合子缺失的現(xiàn)象。

表2 華北落葉種子園親本群體9個(gè)位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)參數(shù)

圖1 引物L(fēng)D67在部分母本和子代中的擴(kuò)增結(jié)果

表3 華北落葉種子園子代群體9個(gè)位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)參數(shù)

2.3 華北落葉松種子園交配系統(tǒng)分析

利用MLTR程序?qū)θA北落葉松1.5代種子園37個(gè)母本單株的193個(gè)子代進(jìn)行分析（表4），9個(gè)位點(diǎn)估算出多位點(diǎn)異交率（tm）為0.829，而單位點(diǎn)異交率（ts）較低為0.465。種子園存在較明顯的雙親近交現(xiàn)象，雙親近交系數(shù)（tm-ts）為0.364。單位點(diǎn)父本相關(guān)性和多位點(diǎn)父本相關(guān)性分別為0.526和0.485，兩者的差值（rp(s)-rp(m)）反映雙親關(guān)聯(lián)度與交配群體結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，本種子園的rp(s)-rp(m)為0.041，表明有部分花粉供體的親緣關(guān)系較近。

表4 華北落葉松種子園交配系統(tǒng)參數(shù)

3 討論與結(jié)論

本研究中親本和子代群體都表現(xiàn)出了較高的遺傳多樣性，期望雜合度分別為0.748和0.791，它們的Shannon’s多樣性指數(shù)分別達(dá)到了1.795和2.034，遠(yuǎn)高于同類研究的檢測(cè)結(jié)果（0.713~0.846）[4，18]。這可能與使用的SSR引物不同且數(shù)量較少有關(guān)。另外，在早先的研究中，位點(diǎn)多態(tài)性數(shù)據(jù)是通過讀取非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的條帶信息得到的，而本研究的結(jié)果是通過ABI 3730XL DNA測(cè)序平臺(tái)讀取的，后者分辨率可高達(dá)1%，能以2~4bp的分辨率高效區(qū)分20~20000bp DNA片段，在200bp處，可清楚分辨2bp差異的條帶，因此能夠獲得更為豐富的位點(diǎn)多態(tài)性數(shù)據(jù)，最終得到的有效等位基因數(shù)也遠(yuǎn)高于前者。

子代群體與親本群體的遺傳多樣性差異不大，甚至略高于親本，子代群體等位基因數(shù)有明顯上升，表明雖然種子園各小區(qū)間有樟子松或云杉作為隔離帶，但參試的1.5代園親本群體依然接收到了其他小區(qū)親本的花粉。親子代間各位點(diǎn)占主導(dǎo)地位的等位基因頻率并沒有顯著差異，固定指數(shù)F基本一致，表明親子代的雜合子水平?jīng)]有發(fā)生明顯變化。證明在連續(xù)的上下2個(gè)世代間遺傳結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生顯著變化[19]。

針葉樹多為風(fēng)媒傳粉，其天然群體或人工群體的異交率大多在90%上下波動(dòng)[19-20]，本研究中華北落葉松育種群體的多位點(diǎn)異交率為0.829（0.044），與早年在華北落葉松天然群體的檢測(cè)結(jié)果基本一致（0.792~0.847）[21]，但單位點(diǎn)異交率較低。近交指數(shù)達(dá)到了0.364，這個(gè)檢測(cè)結(jié)果遠(yuǎn)高于其他以異交為主的樹種，如：馬尾松（-0.031~0.004）[22-23]、紅松（0.027）[24]、翅果油樹（0.086）[25]以及木荷（0.061）[26]等，該結(jié)果表明種子園存在明顯的近親交配現(xiàn)象。這可能與親本的來源有關(guān)，1.5代園母樹主要來自于河北省華北落葉松天然林分中的優(yōu)良單株，而華北落葉松天然林在整個(gè)華北地區(qū)的遺傳分化較小[27]，因此，很容易導(dǎo)致親本群體的親緣關(guān)系較近，甚至母樹本身就是近親交配的后代。

華北落葉松1.5代種子園育種群體的遺傳多樣性較豐富，子代群體也能夠很好的保持親本的高遺傳多樣性，表明該種子園具備良好的育種潛力。但是作為異交為主的針葉樹種，華北落葉松種子園卻出現(xiàn)了明顯的近親交配現(xiàn)象，同時(shí)還觀測(cè)到了雜合子缺失的情況，這對(duì)于種子園的長久發(fā)展會(huì)產(chǎn)生不利影響。在后續(xù)建設(shè)高世代種子園時(shí)應(yīng)采取一些必要的措施，如：親本篩選、控制授粉、引種和種間雜交等，盡量減小近親交配的可能，從而避免近交造成的不良影響。

因?yàn)槭芟拗朴诤Y選出的SSR引物數(shù)量，本研究的結(jié)果都是基于9個(gè)位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析和討論的，較少的位點(diǎn)信息可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)部分偏差，在下一步的研究工作中將嘗試篩選出更多的引物來加強(qiáng)結(jié)果的可信度。