孟 興 佟相慧 陳洪巖 韓凌霞

(中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物與比較醫(yī)學團隊/獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室,黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學重點實驗室，哈爾濱 150069)

干擾素(IFN)是機體免疫調(diào)節(jié)和抗病毒感染的一類重要細胞因子，通過受體介導活化效應細胞發(fā)揮功能。IFN是依據(jù)受體分子劃分的。干擾素I型干擾素的受體廣泛分布于單核細胞、巨噬細胞、B細胞、T細胞、血小板、內(nèi)皮細胞、腫瘤細胞等，II型干擾素的受體與I型干擾素受體有一定的同源性，分布也較廣泛。III型干擾素的受體主要分布于各種內(nèi)皮細胞[1-2]。

Ⅲ型干擾素包含多個IFN-λ家族。目前已鑒定出人有IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3和IFN-λ4等4種[3]，豬有IFN-λ1和IFN-λ3[4]。豬IFN-λ1和IFN-λ3可以抑制豬流行性腹瀉病毒在豬腸內(nèi)皮細胞復制[5]，小鼠IFN-λ可以調(diào)控小鼠諾如病毒在腸黏膜表面的感染[6]。目前文獻報道中只有犬IFN-λ1，公布了IFN-λ3的推測序列[7]，而IFN-λ3在犬體外的基礎(chǔ)表達量如何，尚未見報道。

犬腎小管上皮細胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)是最常用的犬細胞系，來源于考克斯班尼犬腎臟，該腎臟細胞原代培養(yǎng)時其形態(tài)類似于成纖維細胞，經(jīng)過胰蛋白酶/EDTA消化液的連續(xù)6次消化培養(yǎng)而純化成上皮樣細胞，具有遠端腎小管與集合管細胞的分化特性，被廣泛用于代謝研究和藥物篩選研究，尤其是犬病病毒和流感病毒體外培養(yǎng)的支持系統(tǒng)。僅2019年在中國知網(wǎng)上以“MDCK細胞”為關(guān)鍵詞搜索到的正式發(fā)表論文就有18篇，研究內(nèi)容涉及抗生素對MDCK細胞的凋亡[8]、犬病毒感染[9]以及禽流感病毒的研究[10-11]。

聚肌胞苷酸(PolyI∶C)是雙鏈RNA的類似物，常用于干擾素的誘導劑。犬I型腺病毒(CAV-1)引起的犬傳染性肝炎是全球養(yǎng)犬業(yè)和毛皮經(jīng)濟動物養(yǎng)殖業(yè)危害最嚴重的疾病之一，主要通過疫苗免疫[12]。本研究利用定量PCR技術(shù)分別檢測了正常MDCK、Poly I∶C刺激和CAV-1感染后，以初步了解MDCK內(nèi)各種IFN及其受體分子的轉(zhuǎn)錄表達水平。

1 材料與方法

1.1 材料

犬腎細胞系(MDCK)由本實驗室保存。犬腺病毒1型(CAV-1)由軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所扈榮良教授惠贈。PolyI∶C購自Sigma公司；TransStart Tip Green qPCR Super Mix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1不同亞型犬IFN及其受體分子的相對定量PCR方法的建立：用含5%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)MDCK細胞，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)成單層。按照產(chǎn)品說明書，用Simply P總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄(SYBR用)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)NCBI上公布的犬IFN各亞型及其受體分子的核苷酸序列(見表1)，利用Primer 5.0軟件，設(shè)計染料法相對定量PCR(qPCR)方法特異性引物，由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司合成。IFN-α[13]和IFN-λ1[14]的特異性引物來自參考文獻。qPCR反應體系為：2×Trans Start Tip Green qPCR Super Mix 10 μL、引物(10 μmol/L)各1 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 7 μL。反應程序為：94 ℃ 30 s、94 ℃ 5 s、72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。均以GADPH為內(nèi)參。PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒回收，以擴增引物為測序引物，雙向測序。測得的有效序列與NCBI發(fā)布的參考序列進行同源性比對。

表1 犬IFN及其受體分子的相對定量PCR方法的引物信息Table 1 Primer information for quantitative PCR assays for canine IFNs and their receptor molecules

1.2.2MDCK細胞中各干擾素及其受體轉(zhuǎn)錄水平的檢測：正常培養(yǎng)MDCK細胞，長成單層后，棄掉培養(yǎng)液，反復凍融細胞瓶，收獲細胞。同1.2.1方法提取總RNA，隨機引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參基因，以目的基因的Ct值減去內(nèi)參基因的Ct值作為該被檢基因的ΔCt值，通過ΔCt值比較正常MDCK細胞中各IFN及其受體分子的相對含量。

1.2.3Poly I∶C處理的MDCK細胞中各干擾素及其受體轉(zhuǎn)錄水平的檢測：利用100 ng/mL Poly I∶C處理MDCK單層細胞，用2%血清濃度的DMEM培養(yǎng)液于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后收獲細胞。提取以正常MDCK細胞中的作對照，利用定量PCR，檢測MDCK中IFN-β、IFNAR1、IFN-λ1、IFN-λ1R、IFN-λ3和IFN-λ3R轉(zhuǎn)錄水平的相對含量。

1.2.4CAV-1感染MDCK細胞中各干擾素及其受體相對轉(zhuǎn)錄水平的檢測：將MDCK細胞鋪到6孔板中，待密度達到70%～80%，棄去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，PBS洗兩遍。加入MOI=1的CAV-1病毒，37 ℃感作1.5 h后，更換血清終濃度為2%的DMEM維持液，37 ℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后采用凍融方式收獲細胞。設(shè)正常MDCK細胞作對照。提取病毒總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行定量PCR，分析IFN-β、IFN-λ1、IFN-λ3、IFNAR1、IFN-λ1R和IFN-λ3R的相對轉(zhuǎn)錄水平。

1.3 統(tǒng)計方法

對所測樣品的數(shù)值進行計算，用2-ΔΔCt表示，其中ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，ΔΔCt=處理組ΔCt-對照組ΔCt。比較處理組與對照組的目的基因的水平差異。采用SPSS 16.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析。各組數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，用t檢驗分析數(shù)據(jù)，P<0.05為統(tǒng)計學顯著性差異，P<0.01為極顯著。

2 結(jié)果

2.1 犬各干擾素及其受體分子定量PCR方法的建立

以MDCK細胞cDNA為模板，按照優(yōu)化條件，對各IFN分子及其受體分子進行定量PCR反應。熔解曲線可見均為單峰，無雜峰，表明特異性較好(圖1)，各被檢基因可以同時上機反應。Blast序列比對結(jié)果表明，IFN-λ3的擴增產(chǎn)物序列與NCBI發(fā)布的IFN-λ3推測序列XM-02542186.1的同源性為100%。

圖1 犬IFN分子及其受體分子的定量PCR檢測峰圖Fig.1 Results of quantitative PCR of various canine IFNs and their receptor molecules

2.2 MDCK細胞中各干擾素及其受體的水平的檢測

針對內(nèi)參基因GAPDH的相對定量計算結(jié)果表明，培養(yǎng)24 h的MDCK細胞中，IFN-β、IFN-λ1、IFN-λ3、IFNAR1、IFN-λ1R和IFN-λ3R基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都能明顯檢測到，且IFN-λ3R的ΔCt極顯著低于其他被檢分子(P<0.001)，即其轉(zhuǎn)錄含量均極顯著高于其他被檢分子，見圖2。

圖2 MDCK細胞中IFN及其受體分子的相對轉(zhuǎn)錄水平(用循環(huán)數(shù)表示)注：***P<0.001Fig.2 Relative transcriptional levels of various IFNs in MDCK (displayed as cycle numbers)Note：***P<0.001

2.3 Poly I∶C處理的MDCK細胞中各干擾素及其受體轉(zhuǎn)錄水平的檢測

用Poly I∶C處理MDCK細胞24 h后，定量PCR檢測結(jié)果表明，IFN-λ1R的轉(zhuǎn)錄水平最高，極顯著高于IFN-λ1和IFNAR1(P<0.01)，高于IFN-β、IFNAR1、IFN-λ3和IFN-λ3R，但未達到統(tǒng)計學差異，見圖3。

圖3 Poly I∶C處理MDCK細胞中各IFN及其受體分子轉(zhuǎn)錄水平的相對含量注：**P<0.01Fig.3 Comparative expression of mRNA transcription levelsamongIFNs in Poly I∶C-treated MDCK CellsNote：**P<0.01

2.4 CAV-1感染MDCK細胞中各干擾素及其受體相對轉(zhuǎn)錄水平的檢測

MDCK細胞感染CAV-1 24 h后，與正常細胞比較，IFN-α的含量顯著上升，是正常細胞的6倍以上，顯著高于IFN-λ1(P<0.05)，極顯著高于IFN-λ1R、IFNAR1、IFN-λ3、IFN-λ3R和IFN-β的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.01)，見圖4。

圖4 CAV-1感染MDCK細胞后各干擾素及其受體mRNA含量的相對比較注：*P<0.05，**P<0.01Fig.4 Comparison of IFN and its receptor mRNA contents in MDCK cells infected with CAV-1Note：*P<0.05, **P<0.01

3 討論

IFN-λ的受體蛋白IFNLR是IL-28Rα鏈和IL-10Rβ鏈組成的異二聚體，IFN-α/β的受體是IFNAR1和IFNAR2組成的異二聚體IFNAR[15-16]。IFNⅠ型與III型干擾素都有抗病毒的功能，但是IFN-λ比IFN-α/β對內(nèi)皮細胞的作用更強，對黏膜感染更有特異性[17]。例如，IFN-λ通過結(jié)合腸內(nèi)皮細胞表面的受體，能間接調(diào)控小鼠諾如病毒引起的持續(xù)感染、糞排毒以及組織中的病毒含量[6]，而INF II型以免疫調(diào)節(jié)為主。

之前已有報道在正常MDCK內(nèi)檢測到了IFN-λ1R和IFN-λ3轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，但未比較轉(zhuǎn)錄水平[14]。本研究結(jié)果表明，正常MDCK細胞內(nèi)，IFN-β、IFN-λ1和IFN-λ3的轉(zhuǎn)錄水平相近。III型IFN中的λ1受體基因(IFN-λ1R)與I型IFN的受體基因(IFNAR1)轉(zhuǎn)錄水平相近，但均遠低于λ3的受體分子(λ3R)，達到極顯著性差異。

經(jīng)過Poly I∶C刺激24 h后，MDCK內(nèi)轉(zhuǎn)錄出的IFN-β和IFN-λ1接近，雖低于IFN-λ3，但沒有統(tǒng)計學意義。3種被檢受體分子中，IFN-λ1R的含量比正常細胞多了3倍有余，與I型IFN的受體分子基因達到極顯著性，與同是III型的λ3受體無統(tǒng)計學差異。Ichihashi等用Poly I∶C處理MDCK 24 h后，IFN-λ3的轉(zhuǎn)錄水平升高達到了顯著性[14]。

體內(nèi)研究結(jié)果表明，腺病毒能夠介導IFN-γ基因的表達[18]。已有報道表明病毒感染后，Ⅰ型IFN與III型干擾素雖然都有抗病毒功能，二者的受體分子的氨基酸同源性只有30%，但胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導機制類似[19]。MDCK感染I型腺病毒24 h后，除IFN-α的表達量明顯上調(diào)外，其他干擾素及其受體分子之間均無顯著性差異，表現(xiàn)出與Poly I∶C的刺激結(jié)果明顯不同的表達譜。提示在利用Poly I∶C作為刺激劑對照時，應考慮到其代表性。

本研究探討了犬MDCK細胞中I型和III型干擾素受體分子的表達譜，并與Poly I∶C處理和腺病毒感染進行了比較，為利用MDCK開展研究提供了一定思路。