朱金峰 陳沖 陳啟龍

摘 要：采用平板分離技術(shù)，從中煙100煙草品種的根際土壤中分離獲得1株細(xì)菌，將該菌株編號(hào)為ZJFLH3。采用鉬藍(lán)比色法測(cè)定出ZJFLH3菌株經(jīng)過(guò)62h發(fā)酵培養(yǎng)后上清液中的游離態(tài)磷含量明顯增加，濃度達(dá)到了128.3μg/mL，據(jù)此將ZJFLH3菌株初步定性為解磷活性功能菌株。經(jīng)過(guò)對(duì)ZJFLH3菌株的生長(zhǎng)條件初步測(cè)定，結(jié)果表明：ZJFLH3菌株的適宜生長(zhǎng)的溫度范圍是25～35℃，最適溫度為30℃;適宜的pH值范圍是6～7，最適酸堿度環(huán)境為中性偏酸;適宜生長(zhǎng)的鹽濃度范圍是0.15%～0.2%，高鹽不適宜菌株生長(zhǎng)。ZJFLH3菌株可用作煙草菌肥、制劑開(kāi)發(fā)的備用土著菌株。

關(guān)鍵詞：煙草;分離;解磷菌;生長(zhǎng)特性

中圖分類號(hào) S-3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2020）04-0024-03

Abstract： A bacterial strain was isolated from rhizosphere soil of Chinese tobacco 100 by plate separation technique， and the strain was numbered as ZJFLH3. Molybdenum blue colorimetry was used to determine the content of free phosphorus in the supernatant of ZJFLH3 strain after 62 h fermentation culture，and the concentration reached 128.3 g/mL. Based on this， ZJFLH3 strain was preliminarily characterized as a functional strain with antiphosphorous activity. Furthermore， the growth characteristics of ZJFLH3 strain were preliminarily determined. The results showed that the suitable temperature range of ZJFLH3 strain was 25～35℃， and the optimum temperature was 30℃. The optimum pH range is 6～7，and the optimum pH environment is neutral acid. The range of salt concentration suitable for growth is 0.15%～0.2% and High salt is not suitable for strain growth. ZJFLH3 strain can be used as an alternative indigenous strain for tobacco fertilizer and preparation development.

Key words： Tobacco; Isolation; Dephosphorization bacteria; Growth characteristics

磷是作物正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的礦質(zhì)元素之一，是植物體內(nèi)核酸、多種酶類、三磷酸腺苷等的重要組成部分。作物缺磷時(shí)，常表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢、分枝少、矮小瘦弱;葉片易脫落，色澤呈暗綠或灰綠色，并常出現(xiàn)紫紅色;植物根系發(fā)育受阻，成熟推遲，產(chǎn)量和品質(zhì)均顯著降低[1-3]。土壤中含有大量的磷元素，但磷多以有機(jī)和無(wú)機(jī)的高分子化合態(tài)存在，植物并不能直接吸收利用。我國(guó)約有74%的耕地天然缺磷，在作物發(fā)育周期中及時(shí)足量補(bǔ)充磷肥尤為重要[4，5]。在磷肥的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用實(shí)踐中，除了傳統(tǒng)化學(xué)磷肥的廣泛使用之外，生物磷肥逐漸得到重視和應(yīng)用，其理論基礎(chǔ)是土壤中的磷素循環(huán)以微生物活動(dòng)為中心，微生物的活動(dòng)對(duì)土壤磷的轉(zhuǎn)化和有效性影響很大[2，5]。研究表明[6-8]，土壤中存在大量的具有解磷功能的微生物，其可以將植物難以吸收利用的難溶性磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用的可溶性磷。因此，開(kāi)展解磷菌的篩選、鑒定、活性評(píng)估及功能菌株的生長(zhǎng)特性研究，對(duì)開(kāi)發(fā)生物磷肥具有重要意義。本研究以煙草根際土壤為材料，對(duì)解磷菌進(jìn)行了篩選、活性測(cè)定及生物學(xué)特性研究等，以期豐富生物磷肥開(kāi)發(fā)的野生土著微生物資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 土壤樣品采自漯河市煙草公司煙草生產(chǎn)田，煙草品種是中煙100。解磷菌平板分離培養(yǎng)基：葡萄糖5g，硫酸銨0.5g，氯化鈉0.5g，氯化鉀0.3g，七水硫酸鎂0.3g，硫酸亞鐵0.03g，四水硫酸錳0.03g，磷酸鈣8g，瓊脂粉20g，pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5g，硫酸銨0.5g，氯化鈉0.5g，氯化鉀0.3g，七水硫酸鎂0.3g，硫酸亞鐵0.03g，四水硫酸錳0.03g，磷酸鈣8g，pH7.0?；罨囵B(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉10g，pH7.2?；A(chǔ)培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，pH7.2。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株篩選 稱取中煙100煙草根際土樣5g，加入已滅菌的盛有45mL無(wú)菌水的三角瓶中。震蕩混勻30min，然后靜置30s，此混懸液認(rèn)定為10-1濃度的土壤稀釋母液。再按10倍梯度稀釋法在無(wú)菌操作條件下依次稀釋至10-6濃度。試驗(yàn)分別選取10-4、10-5和10-6 3個(gè)梯度稀釋液，并分別吸取0.1mL涂布于解磷菌平板分離培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)4 d。選取生長(zhǎng)良好、特征典型、解磷圈明顯的單菌落進(jìn)行連續(xù)3次的劃線純化，獲得目標(biāo)菌株。

1.2.2 目標(biāo)菌株解磷活性的定量測(cè)定 將分離獲得的具有解磷活性菌株采用鉬藍(lán)比色法測(cè)定解磷能力，操作步驟參考文獻(xiàn)進(jìn)行[9]。

1.2.3 影響目標(biāo)菌株生長(zhǎng)的因素 溫度：首先將目標(biāo)菌株在活化培養(yǎng)基中活化（菌懸液OD600=0.2），以0.1%的接種量接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，并分別在15、20、25、30、35、40和45℃溫度梯度下，180r/min震蕩培養(yǎng)12h，分光光度計(jì)測(cè)定600nm處的OD值。3次重復(fù)取平均值，下同。pH：首先將目標(biāo)菌株在活化培養(yǎng)基中活化（菌懸液OD600=0.2），以0.1%的接種量接入調(diào)配好pH值的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的pH值分別為3、4、5、6、7、8、9和10，180r/min條件下震蕩培養(yǎng)12h，分光光度計(jì)測(cè)定600nm處的OD值。NaCl：首先將目標(biāo)菌株在活化培養(yǎng)基中活化（菌懸液OD600=0.2），以0.1%的接種量接入調(diào)配好NaCl含量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，NaCl含量（W/V）分別為0、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、1%、2%、3%和4%，180r/min條件下震蕩培養(yǎng)12h，分光光度計(jì)測(cè)定600nm處的OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 獲得菌株 試驗(yàn)通過(guò)解磷菌平板分離培養(yǎng)，獲得3株具有明顯解磷圈的菌株，其中解磷圈最大的菌株單菌落呈淡黃色，菌落較大，邊緣整齊，在培養(yǎng)基表面微凸，半濕潤(rùn)（圖1），初步定性為具有解磷活性的目標(biāo)菌株，并將其編號(hào)為ZJFLH3。

2.2 ZJFLH3的解磷活性 采用鉬藍(lán)比色法，對(duì)分離獲得的菌株ZJFLH3的解磷活性進(jìn)行定量測(cè)定，結(jié)果表明，目標(biāo)菌株ZJFLH3經(jīng)過(guò)連續(xù)74h發(fā)酵，發(fā)酵液培養(yǎng)基上清液中游離態(tài)磷含量存在動(dòng)態(tài)變化，發(fā)酵的前50h，游離態(tài)磷含量隨時(shí)間延長(zhǎng)而不斷增大，發(fā)酵50h時(shí)達(dá)到最大值141.6μg/mL;發(fā)酵50h以后，游離態(tài)磷含量略有下降。而空白對(duì)照始終都未檢測(cè)到游離態(tài)磷含量的變化，進(jìn)一步說(shuō)明目標(biāo)菌株ZJFLH3具有解磷功能（圖2）。

2.3 影響ZJFLH3的生長(zhǎng)因素

2.3.1 溫度 由圖3可知，菌株ZJFLH3在20℃以下時(shí)OD值較小，說(shuō)明菌株生長(zhǎng)較為緩慢，高于20℃時(shí)，OD值增長(zhǎng)幅度迅速增大，至30℃時(shí)到達(dá)最大值;30℃以上溫度條件下OD值開(kāi)始變小，說(shuō)明菌株生長(zhǎng)變慢，至35℃時(shí)，OD值開(kāi)始迅速下降。整體而言，菌株ZJFLH3在25～35℃溫度范圍時(shí)生長(zhǎng)良好，最適生長(zhǎng)溫度可確定為30℃。

2.3.2 酸堿度 菌株ZJFLH3在pH值小于5或大于8時(shí)均表現(xiàn)出極低生長(zhǎng)速度;pH大于5.0時(shí)，生長(zhǎng)速度迅速增加，至7.0時(shí)OD值達(dá)到最大值，大于7.0時(shí)，OD值下降迅速，整體而言，說(shuō)明菌株ZJFLH3適宜于在中性偏酸性環(huán)境生長(zhǎng)，在堿性環(huán)境生長(zhǎng)速度受到明顯抑制;當(dāng)pH小于5或和大于8時(shí)，OD值都處于極低水平，說(shuō)明強(qiáng)酸和強(qiáng)堿環(huán)境均不適合菌株生長(zhǎng)。故菌株生長(zhǎng)的適宜pH值范圍認(rèn)定為6～7，最適酸堿度環(huán)境為中性偏酸（圖3）。

2.3.3 鹽濃度 由圖5可知，當(dāng)NaCl含量介于0.15%～0.2%范圍時(shí)，OD值均處于較高水平，變化幅度較小，說(shuō)明此濃度范圍適宜菌株ZJFLH3生長(zhǎng);當(dāng)大于0.2%時(shí)，OD值下降迅速，當(dāng)大于1%時(shí)，OD值開(kāi)始維持在較低水平，說(shuō)明不利于菌株生長(zhǎng);NaCl含量在0～0.1%范圍內(nèi)，OD值隨濃度的提高而增大。整體而言，菌株ZJFLH3生長(zhǎng)的適宜鹽濃度范圍是0.15%～0.2%，高鹽不利于菌株生長(zhǎng)。

3 討論

土壤中的解磷微生物既有可以對(duì)有機(jī)磷進(jìn)行降解礦化作用的類群，也有將無(wú)機(jī)固定態(tài)磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷的種類，故根據(jù)解磷菌作用對(duì)象的不同，可將解磷菌分為有機(jī)磷微生物和無(wú)機(jī)磷微生物[2-6]。本研究通過(guò)無(wú)機(jī)磷平板分離培養(yǎng)基分離獲得的菌株ZJFLH3，形成的溶解圈明顯。經(jīng)過(guò)對(duì)連續(xù)發(fā)酵上清液中和培養(yǎng)基上清液中游離態(tài)磷含量的動(dòng)態(tài)檢測(cè)表明，游離態(tài)磷含量顯著增加，且最大濃度達(dá)到了128.3μg/mL，因而可將菌株ZJFLH3定性為具有解磷功能菌株，可作為煙草生物磷肥開(kāi)發(fā)研究的備用菌株資源。本研究還考察了溫度、酸堿和鹽濃度對(duì)菌株ZJFLH3生長(zhǎng)發(fā)育的影響，該菌株適宜生長(zhǎng)溫度為25～35℃，適宜酸堿度為6～7，適宜鹽濃度為0.15%～0.2%。

大量研究表明[10-12]，土著功能菌株天然的功能活性往往較低，很多菌株達(dá)不到直接開(kāi)發(fā)成商品的條件，通過(guò)誘變育種提高功能菌株的功能活性，是后期研究的重點(diǎn)內(nèi)容之一。因此，后續(xù)工作將開(kāi)展對(duì)菌株ZJFLH3的誘變育種，提高解磷活性，并優(yōu)化其發(fā)酵條件，為菌株ZJFLH3的開(kāi)發(fā)用于提供更加充分的條件。

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（責(zé)編：王慧晴）