陳健芬 郭 慶 孫東方 吳文惠 蔡吳鳳 任 格

(1.蘇州市金茂日用化學(xué)品有限公司，江蘇 蘇州 215341；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；3.黑龍江省輕工科學(xué)研究院，黑龍江 哈爾濱 150010；4.徐州工程學(xué)院，江蘇 徐州221018)

前言

血小板是一種具有膜結(jié)構(gòu)的血液成分，在血液中發(fā)揮作用，主要是靠多種表面受體及存在于血小板中的可溶性介質(zhì)來進行的。在正常的血液循環(huán)過程中，血小板處于穩(wěn)定的靜止?fàn)顟B(tài),當(dāng)血管壁出現(xiàn)損傷時，通過表面接觸和某些凝血因子的作用，血小板轉(zhuǎn)入激活狀態(tài)，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象[1-3]。白芨提取物可通過增強血小板血栓素A2(TXA2)的活性進而增加血栓素B2(TXB2)含量，縮短凝血酶原時間，TXB2含量增多時，血小板凝聚活性越強[4]。白芨提取物還可通過抑制纖維蛋白酶活性從而降低血漿中環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量，使血細胞凝集形成人工血栓達到止血效果[5]。因而選擇檢測血小板聚集率、TXB2含量和cAMP含量3項指標(biāo)，以評價添加白芨提取物或氨甲環(huán)酸的牙膏對牙齦出血的抑制效果。本研究建立可量化的血小板體外生物模型，探索口腔清潔護理產(chǎn)品及原材料對牙齦止血作用的有效性。

炎癥是機體組織對內(nèi)外環(huán)境的有害刺激所產(chǎn)生的一種復(fù)雜的生理和病理反應(yīng)。人牙齦上皮細胞(HGECs)為多角形，融合呈典型的“鋪路石”外觀。免疫細胞化學(xué)檢測顯示，該細胞角蛋白染色陽性，波形絲蛋白染色陰性，證實其為外胚層來源的細胞[6，7]。炎癥因子IL-1β具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生前列腺素E2、IL-2等炎癥介質(zhì)[8]。炎癥因子IL-6可影響淋巴細胞的增殖分化，促進B淋巴細胞產(chǎn)生抗體，有利于機體抗感染，同時還可抑制成骨細胞膠原和非膠原蛋白的合成，作用于破骨細胞的前體而促進骨吸收[9]?？寡滓蜃覫L-10是一種能趨化中性多形核白細胞、T淋巴細胞和單核細胞等免疫細胞的細胞因子，能夠明顯抑制炎癥反應(yīng)，在牙周炎的免疫反應(yīng)中起中樞作用[10]。TNF-α是一種腫瘤壞死因子，主要由活化的巨噬細胞、NK細胞和T淋巴細胞產(chǎn)生，由于其缺少靶向性且有嚴(yán)重的副作用目前僅用于局部治療[11]。上述細胞因子分泌水平的變化，對于研究牙周組織的炎癥及免疫耐受性具有非常重要的意義。牙周病原菌內(nèi)毒素(LPS)是一種由類脂A、核心寡聚糖和O-特異性多糖側(cè)鏈組成的糖脂類物質(zhì)，是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分?？芍苯幼饔糜谘乐芙M織細胞，刺激單核細胞和巨噬細胞等效應(yīng)細胞，誘發(fā)炎癥反應(yīng)從而引起牙周組織的破壞[12，13]。同時，它也是一種潛在的細胞激活因子，對牙周炎的產(chǎn)生發(fā)揮著重要的作用。當(dāng)前體外炎癥模型的細胞大多運用的是RAW264.7巨噬細胞[14]，而對人牙齦上皮細胞(HGECs)研究較少，本研究甄選了口腔中抵御病原微生物入侵的第一道屏障的HGECs為細胞模型，其更加貼切人體口腔粘膜組織結(jié)構(gòu)，更具科學(xué)性、安全性及代表性 。

因牙齦炎是由茵斑微生物引起的牙周組織慢性感染疾病，其主要表現(xiàn)上皮和結(jié)締組織的破壞及牙槽骨的喪失[15]。1998年GeorgeHajishengallis等[16]人研究200g左右的大鼠口腔相當(dāng)于人類成年45～65周歲的口腔環(huán)境，因此選用200g的雌性大鼠作為研究對象。常規(guī)的大鼠牙齦炎模型使用復(fù)合結(jié)扎的方式誘導(dǎo)牙齦炎大鼠模型，在結(jié)扎后需頻繁更換絲線，實驗步驟繁瑣，耗時耗力[17，18]。本實驗摸索出了在構(gòu)建絲線結(jié)扎磨牙牙齦炎大鼠模型時，同時選用牙齦卟啉單胞菌(P.g)和具核梭桿菌(F.n)誘導(dǎo)[19]。以達到更快捷、更安全地建立大鼠牙齦炎模型的目的，通過檢測大鼠牙齦指數(shù)(GI)、菌斑指數(shù)(PI)和牙齦探診出血指數(shù)(BOP)，結(jié)合觀察X-ray形態(tài)指標(biāo)，再進一步對唾液中免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)以及血漿中細胞因子IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α含量的檢測，從各方面佐證體外HGECs牙齦炎癥模型與大鼠體內(nèi)牙齦炎模型檢測結(jié)果的一致性。

1 方法與結(jié)果

1.1 材料與分析

1.1.1 試劑與儀器

P.gingivalis(ATCC33277)，F(xiàn).nucleatum(ATCC49256)，HGECs(上海賽齊生物技術(shù)公司)；Wistar大鼠、雌性新西蘭兔(SPF級，上海杰思捷實驗動物有限公司)；二磷酸腺苷(ADP，美國Sigma-Aldrich 公司，批號A2754)，水合氯醛(Chloralhydrate，10%，PH7.2)ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)；DMEM高糖培養(yǎng)基，0.25%胰酶，胎牛血清，青霉素和鏈霉素(美國Gibco 公司)；其他分析純試劑均采購于國藥、生工等國內(nèi)試劑供應(yīng)商。

1.1.2 主要試劑的配制

牙膏樣品前期處理：分別將白芨Ⅰ號牙膏、白芨Ⅱ號牙膏、陰性對照牙膏、添加氨甲環(huán)酸的牙膏四組樣品水浴浸提，浸提液過濾后離心取上清液后減壓旋蒸(40℃、75轉(zhuǎn))至最初牙膏體積，置于真空干燥箱中干燥6h，再冷凍干燥得到牙膏的供試樣品，供試樣品及白芨提取物用0.9%的生理鹽水或DMEM培養(yǎng)基復(fù)溶(表1)，0.22μm的濾膜過濾,4℃保存?zhèn)溆?1周內(nèi)用完)。

表1 實驗用體外血小板模型的牙膏樣品處理濃度

菌液的制備：P.g和 F.n接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在37℃厭氧條件下培養(yǎng)2～5d，挑取平板上單個菌落用無菌PBS(50mmol/L，pH=7.4)配制菌懸液5mL，并調(diào)節(jié)為0.5麥?zhǔn)媳葷釢舛?1x108CFU/mL)，然后加入羧甲基纖維素，用0.22μm孔徑的濾膜過濾，配制成含2%羧甲基纖維素的新鮮菌液。

細胞培養(yǎng)：HGECs移至含有10%熱滅活牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基中，添加1%100μg/mL的青霉素和鏈霉素，于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。及時換液并傳代培養(yǎng)，取5～6代生長狀態(tài)呈對數(shù)期的細胞進行試驗。

表2 主要儀器

1.1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0軟件包分析處理實驗數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析和LSD檢驗比較組間的差異。所有組的數(shù)據(jù)使用K-S檢驗正態(tài)性，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)為正態(tài)性分布，使用單因素方差分析對各組相應(yīng)指標(biāo)的均數(shù)進行顯著性檢驗，并通過LSD檢驗進行樣本均數(shù)的兩兩比較，以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 建立基于血小板生理變化的體外實驗?zāi)Ｐ?/h3>

1.2.1 試驗方法

采用心臟采血法13收集新西蘭雌性大白兔新鮮血液，離心后將血小板密度調(diào)整為1×1012/L，按照設(shè)計的實驗方案檢測空白時的吸光度OD0，按照試驗的分組情況加入不同的牙膏樣品(5ul/well)，輕微震蕩。再將該96孔板置于37℃下恒溫孵育5分鐘，充分反應(yīng)。隨后加入5ul的ADP溶液輕微震蕩以誘導(dǎo)血小板聚集，血小板出現(xiàn)聚集反應(yīng)后，相應(yīng)體系內(nèi)的濁度會發(fā)生變化。根據(jù)酶標(biāo)儀中的OD值的變化計算血小板聚集率，其計算公式如下。按照ELISA試劑盒說明書檢測兔血漿中的cAMP、TXB2含量。

1.2.2 體外兔血小板生物模型中血小板聚集率、TXB2、cAMP含量的結(jié)果

采用兔血漿并通過ADP誘導(dǎo)血小板活化，檢測樣品處理組孵育血小板后的血小板聚集率、血小板生理代謝的主要產(chǎn)物TXB2及生命信息傳遞信使cAMP，每組重復(fù)5次，結(jié)果如圖1。

樣品A：白芨Ⅰ號牙膏；樣品B：白芨Ⅱ號牙膏；樣品C：陰性對照牙膏；樣品D：氨甲環(huán)酸牙膏；樣品E：白芨提取物。P<0.05用*表示；P<0.01用**表示；P<0.001用***表示。

血小板聚集率是反映血小板凝聚功能的重要指標(biāo)，是止血功能的最早反應(yīng)，血小板聚集率增高時則呈現(xiàn)血栓狀態(tài)[20]。樣品A、B、C、D、E處理后稀釋為0.05%～0.80%，檢測其對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率的影響，其中濃度為0.10%～0.40%的各牙膏樣品效果較顯著。結(jié)果表明：0.20%左右的白芨提取物(E)的血小板聚集率最高，比陰性對照牙膏(C)高出為32.27%±3.07%(P<0.05)。其次是稀釋為0.10%的氨甲環(huán)酸牙膏(D)，血小板聚集率比陰性對照牙膏高28.96%±2.66%(P<0.05)，白芨Ⅰ號牙膏和白芨Ⅱ號牙膏的血小板聚集率也均有顯著性增高(P<0.01)，說明添加有白芨提取物或氨甲環(huán)酸的牙膏均有明顯的止血效果。

樣品A：白芨Ⅰ號牙膏；樣品B：白芨Ⅱ號牙膏；樣品C：陰性對照牙膏；樣品D：氨甲環(huán)酸牙膏；樣品E：白芨提取物。P<0.05用*表示；P<0.01用**表示；P<0.001用***表示。

TXB2是血小板花生四烯酸代謝途徑環(huán)氧化酶的主要產(chǎn)物之一，白芨提取物及其牙膏和氨甲環(huán)酸牙膏可促進血小板環(huán)氧化酶[21]，因此檢測白芨提取物及其添加白芨提取物或氨甲環(huán)酸牙膏刺激血小板體外模型后血小板分泌TXB2的含量來推斷血小板的活性，TXB2含量越高，表示血小板生理活性越活躍。結(jié)果表明：稀釋為0.40%左右的白芨提取物的效果最為顯著，TXB2含量比正常血漿高7.11ng/L±0.22ng/L(P<0.001)；其次氨甲環(huán)酸牙膏、白芨Ⅰ號牙膏和白芨Ⅱ號牙膏也能顯著性增加血漿中TXB2含量(P<0.01)。

樣品A：白芨Ⅰ號牙膏；樣品B：白芨Ⅱ號牙膏；樣品C：陰性對照牙膏；樣品D：氨甲環(huán)酸牙膏；樣品E：白芨提取物。P<0.05用*表示；P<0.01用**表示；P<0.001用***表示。

在血小板中，cAMP可通過蛋白激酶A有效地刺激膜上的一種蛋白磷酸化，并通過對鈣攝入的影響，調(diào)節(jié)血小板收縮的生理功能[22]，而白芨提取物及其牙膏可抑制蛋白激酶的活化從而影響cAMP分泌，cAMP含量越高表示血小板越呈老化狀態(tài)[23]。結(jié)果表明：0.40%左右的氨甲環(huán)酸牙膏組的效果最為顯著，cAMP含量比正常血漿低292.53nmol/L±2.32nmol/L(P<0.01)，而白芨提取物、白芨Ⅰ號牙膏與白芨Ⅱ號牙膏組也能顯著性減少cAMP含量(P<0.05)。

1.3 體外HGECs牙齦炎模型的細胞因子IL-6、IL-1β、IL-10、TNF-α變化

1.3.1 細胞活性檢測

CCK-8試劑可用于檢測牙膏樣品對HGECs細胞增殖和毒性分析，根據(jù)加藥后細胞存活率以篩選HGECs的最適牙膏樣品濃度值[24]。加入濃度梯度的牙膏樣品處理(含10μg/mLLPS)，充分孵育后加入CCK-8試劑，用酶標(biāo)儀測量550nm處各孔的吸光值，細胞存活率在80%-100%的牙膏樣品濃度為對HGECs最安全也是最適宜的處理濃度。

樣品A：白芨Ⅰ號牙膏；樣品B：白芨Ⅱ號牙膏；樣品C：陰性對照牙膏；樣品D：氨甲環(huán)酸牙膏；樣品E：白芨提取物。

CCK-8試劑用于添加白芨提取物或氨甲環(huán)酸牙膏最適濃度的篩選，具有靈明度高、細胞毒性小、結(jié)果優(yōu)于MTT等多種優(yōu)點[25]。結(jié)果顯示：采用0.5ug/ml樣品濃度評價各組牙膏樣品的抗炎作用最適(P<0.05)。

1.3.2 HGECs牙齦炎模型中細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的檢測結(jié)果

采用酶聯(lián)免疫吸附法20檢測經(jīng)LPS誘導(dǎo)，牙膏樣品孵育后的HGECs所分泌細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的含量，依IL-6、IL-1β、IL-10、TNF-α的ELISA試劑盒說明書檢測。每個實驗重復(fù)5次，結(jié)果如下圖。

樣品A：白芨Ⅰ號牙膏；樣品B：白芨Ⅱ號牙膏；樣品C：陰性對照牙膏；樣品D：氨甲環(huán)酸牙膏；樣品E：白芨提取物。P<0.05用*表示；P<0.01用**表示；P<0.001用***表示。

IL-10為抗炎因子，可通過釋放免疫介質(zhì)從而達到抑制炎癥作用；IL-1β、IL-6為炎癥因子，當(dāng)機體發(fā)生炎癥時這兩種細胞因子相應(yīng)增加[18]；TNF-α是一種腫瘤壞死因子，可通過引起一些炎癥反應(yīng)使腫瘤細胞出血性壞死。Control為經(jīng)LPS誘導(dǎo)后的HGECs炎癥模型。結(jié)果表明：經(jīng)氨甲環(huán)酸牙膏組處理HGECs分泌的IL-10含量最高，為98.95ng/L±2.42ng/L(P<0.001)；IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子TNF-α含量最低，分別為6.12ng/L±0.02ng/L，6.36ng/L±0.04ng/L(P<0.01)，13.09ng/L±0.01ng/L(P<0.01)；其中白芨提取物、白芨Ⅰ號牙膏和白芨Ⅱ號牙膏對HGECs炎癥模型分泌的細胞因子也均表現(xiàn)有顯著性差異(P<0.05)。

1.4 建立大鼠牙齦炎模型——驗證HGECs體外牙齦炎模型的有效特性

1.4.1 試驗方法

SPF級Wistar大鼠共20只，雌性，體重200±20g，活動良好，無齲壞，無牙周病。大鼠腹腔注射10%水合氯醛3.5mg/kg麻醉后，選擇雙側(cè)上頜第二磨牙用5-0醫(yī)用絲線結(jié)扎于牙頸部，結(jié)扎絲線盡量放入齦溝內(nèi)，遇結(jié)扎線脫落需重新結(jié)扎(圖6)。結(jié)扎后用10%糖水代替飲水喂養(yǎng)，每隔一天接種一次制備好的菌液0.5ml。建模成功后給試樣15d，檢測大鼠唾液的免疫球蛋白igG、igM、igA因子(表3)，GI、PI、BOP結(jié)果(圖7)，大鼠血漿中的炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6因子(圖8)和X-ray形態(tài)學(xué)分析(圖9)。

圖6 大鼠牙齦炎第二磨牙的絲線結(jié)扎

1.4.2 試驗結(jié)果

用酶聯(lián)免疫吸附法22檢測第三、六周大鼠口腔中唾液分泌的免疫球蛋白IgG、IgM及IgA，采用探針檢測各組大鼠口腔的牙齦指數(shù)，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測用藥15d的大鼠血漿中細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的含量，每組重復(fù)3次，結(jié)果如表3。

表3 各組大鼠唾液的IgG、IgM、IgA比較

IgA為分泌性的免疫球蛋白A，是機體抵御病原體的第一道免疫防線，有效地阻止口腔中有害物質(zhì)進入上皮細胞[26]；IgM為免疫球蛋白M，是免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體，可根據(jù)其含量來評價口腔中牙齦炎的修復(fù)作用[27]；IgG是免疫球蛋白G，是血清中主要的抗體成分，唾液中含量極低。對照組(F)為患嚴(yán)重牙齦炎的大鼠模型，空白組(G)為牙齦健康的大鼠。結(jié)果表明：氨甲環(huán)酸牙膏處理后IgA的變化最為明顯，增加了1.18mg/L(P<0.01)；白芨Ⅰ號牙膏處理后IgM增加了410ng/L(P<0.01)；而IgG在第三周大鼠口腔發(fā)炎嚴(yán)重時,由于牙齦易出血導(dǎo)致能在口腔唾液中到大量血清中的IgG，但第六周牙膏處理后則恢復(fù)正常值。

A：白芨Ⅰ號牙膏組；B：白芨Ⅱ號牙膏組；C：陰性對照牙膏組；D：氨甲環(huán)酸牙膏組；E：白芨提取物組；F：對照組；*P<0.01；**P<0.01；***P<0.001

牙齦指數(shù)GI通過檢查牙齦顏色和質(zhì)的改變評價口腔的健康情況，菌斑指數(shù)PI根據(jù)牙面菌斑的厚度評價口腔中牙周病防治效果，牙齦出血指數(shù)BOP則是通過探針刺激牙齦部分評價口腔牙齦的病理狀況[28,29]。對照組(F)為患牙齦炎的大鼠模型。結(jié)果表明：大鼠牙齦炎模型中，白芨提取物處理的大鼠口腔GI、PI、BOP均顯著性減少(P<0.001)，其次是白芨牙膏和氨甲環(huán)酸牙膏處理組(P<0.01)，表明白芨提取物和添加有白芨提取物或氨甲環(huán)酸的牙膏對口腔牙齦炎均有顯著的治愈作用。

A：白芨Ⅰ號牙膏組；B：白芨Ⅱ號牙膏組；C：陰性對照牙膏組；D：氨甲環(huán)酸牙膏組；E：白芨提取物組；F：對照組；G：空白組。(#P<0.05；##P<0.01；###P<0.001vs.Fgroups；* P<0.01；** P<0.01；***P<0.001vs.Ggroups)

對照組(F)為患嚴(yán)重牙齦炎的大鼠模型，空白組(G)為牙齦健康的大鼠。結(jié)果表明：白芨提取物處理組的血漿中IL-10含量最高，為27.98ng/L±1.22ng/L(P<0.05)；IL-1β、IL-6、TNF-α含量最低，分別為12.26ng/L±0.30ng/L(P<0.001)，2.62ng/L±0.01ng/L(P<0.001)，103.99ng/L±4.37ng/L(P<0.001)；添加白芨提取物或氨甲環(huán)酸牙膏組對大鼠牙齦炎模型也均有顯著性修復(fù)效果(P<0.05)。

給試樣15d后，大鼠上頜牙周組織的X射線顯示牙槽骨影像如圖9。

對照組(F)為患有嚴(yán)重牙齦炎的大鼠口腔上顎，由對照組中星號處可觀察到明顯的銀乳頭退縮和炎性細胞浸澗，銀乳頭位于釉牙骨質(zhì)界下方，牙槽帷高度降低，牙槽崎頂?shù)接匝拦琴|(zhì)界的距離顯著増加。圖9中A、B、D、E是各組牙膏修復(fù)后的大鼠牙銀組織，與對照相比，各實驗組牙膏處理牙齒排列緊密，牙齒與牙槽貼合緊密，從給試樣組星號處可觀察到大鼠第二磨牙與相鄰磨牙間隙明顯減小。而陰性對照牙膏處理組(C)處理的第二磨牙與相鄰磨牙間隙與空白組相比變化不明顯。結(jié)果表明：白芨提取物和添加白芨提取物或氨甲環(huán)酸的牙膏可明顯改善牙周炎大鼠牙間隙以及牙齒與牙槽縫隙。

A：白芨Ⅰ號牙膏處理組；B：白芨Ⅱ號牙膏處理組；C：陰性對照牙膏組；D：氨甲環(huán)酸牙膏處理組；E：白芨提取物處理組；F：對照組☆：牙槽骨吸收；★：牙槽骨修復(fù)

2 討論與結(jié)論

2.1 長期以來針對口腔清潔護理產(chǎn)品的此類抗牙齦炎及牙齦出血等功效的的臨床評價，存在著成本高、耗時長，對受試者控制難，操作繁瑣，且臨床測試結(jié)果達不到預(yù)期等局限性，同時還存在一定的盲目性。因此建立體外血小板、牙齦炎的生物模型，作為未來口腔清潔護理產(chǎn)品及其材料功效作用的研究與評價，具有充分必要性。

2.2 血小板活化是一個自我放大的級聯(lián)反應(yīng)。ADP誘導(dǎo)的血小板聚集及凝血因子的檢測廣泛用于止血藥物的評價，其中cAMP和TXB2在該條止血途徑發(fā)揮主要作用[30]。白芨Ⅰ號牙膏、白芨Ⅱ號牙膏、陰性對照牙膏、氨甲環(huán)酸牙膏和白芨提取物稀釋為40%時差異極顯著(P<0.05)，其血小板聚集率分別是61.64%、61.26%、57.59%、65.56%、75.23%；cAMP含量分別為330.61nmol/L、416.56nmol/L、449.78nmol/L、244.60nmol/L、313.41nmol/L；TXB2含量分別為6.22ng/L、5.88ng/L、5.43ng/L、10.04ng/L、11.36ng/L。研究結(jié)果表明在體外血小板生物模型中，體外止血效果依次為：白芨提取物>氨甲環(huán)酸牙膏組>白芨Ⅰ號組>白芨Ⅱ號牙膏組>陰性對照牙膏組。同期采用的動物體內(nèi)實驗,以X-ray組織觀察、探針出血指數(shù)(BOP)、唾液中免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)等含量為評價指標(biāo)，結(jié)果顯示牙膏樣品在動物體內(nèi)與體外的血小板生物模型上的止血效果呈正相關(guān)性。因此，本研究建立的以血小板生物模型作為未來代替動物體內(nèi)實驗，探索出了新的研究思路與方向，并且驗證了未來可運用血小板生物模型作為代替動物體內(nèi)的牙齦止血實驗的可行性。

2.3 通常LPS耐受的研究主要集中于單核/巨噬細胞等免疫細胞。還尚缺乏HGECs免疫耐受的直接報道，Muthukuru的研究已證實，慢性牙周炎患者的牙齦組織中，HGECs能夠識別LPS等毒力因子[31,32]，因此研究選擇最貼近最外層易感染的HGECs作為研究對象。CCK-8檢測顯示選擇0.5ug/mL的樣品濃度檢測炎癥因子，白芨Ⅰ號牙膏、白芨Ⅱ號牙膏、陰性對照牙膏、氨甲環(huán)酸牙膏和白芨提取物對LPS刺激HEGCs細胞上清液中IL-10含量均呈極顯著性增加(P<0.001)，IL-6顯著性減少(P<0.01)，TNF-α一般性減少(P<0.05)，IL-1β無明顯差異。通過比對大鼠血漿中細胞因子IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α含量及牙齦炎模型探針牙齦診斷(GI、PI)，為驗證上述實驗樣品牙膏對牙齦炎的抑制作用取得了重大突破。研究表明牙膏在動物體內(nèi)炎癥介質(zhì)和細胞因子的抑制作用與體外HGECs牙齦炎模型的檢測結(jié)果具有一致性，為未來逐漸淘汰動物體內(nèi)炎癥模型提供了可靠的方法依據(jù)。

2.4 目前，我國在針對口腔清潔護理產(chǎn)品(含氟防齲再礦化、除漬美白除外)的體外功效評價模型的建立上，尚缺乏快速、便捷、可靠的方法或手段。研究結(jié)果表明，建立體外血小板、牙齦炎的生物模型，通過對酶分子水平和細胞因子表達的考察，并與體內(nèi)大鼠牙齦炎模型作結(jié)果一致性的驗證。實現(xiàn)了在較短時間內(nèi)評價口腔清潔護理用的材料及其產(chǎn)品的功效。從而提升了原材料及其產(chǎn)品功效研究的時效性，大大降低了資金投入成本，更是提供了快捷、高效、可靠且更具安全、科學(xué)性的評價手段。同時也為口腔清潔護理用品行業(yè)對相關(guān)產(chǎn)品的功效驗證提出了一種新的思路與途徑。此外，通過本研究摸索，為日后進一步深入探究功效材料及其產(chǎn)品對口腔細胞在核酸、蛋白及分子水平方面的作用機制做了鋪墊。