張貴賢 李木松 魏媛媛 秦 維 陳 暉

(保定市傳染病醫(yī)院 1. 結核二科 2. 五病區(qū) 3. 四病區(qū) 4. 六病區(qū)， 保定 071000)

肝纖維化(liver fibrosis，LF)是由各種原因引起的肝臟中纖維和結締組織增生沉積和纖維分解下降引起的[1]。Caspase是一類富含半胱氨酸的蛋白酶，其中Caspase-12是參與細胞凋亡的主要蛋白，并且Caspase-12相關通路在LF中上調[2]。Smad2和基質金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)可通過調節(jié)上皮間充質轉化和細胞外機制的降解參與LF的發(fā)生和發(fā)展[3]。茵陳蒿湯是一種歷史悠久的中醫(yī)方劑，具有清熱，利濕，退黃之功效，有研究認為茵陳蒿湯具有治療LF的作用，但是關于其機制尚不明確[4]。因此本文主要分析茵陳蒿湯對LF大鼠的治療作用，并分析其對Caspase-12通路、TIMP-1、Smad2的影響，分析其可能的治療機制，為臨床更好地治療LF提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠45只，體質量180～210 g，購自河北醫(yī)科大學動物實驗中心，動物生產合格證編號：1703371。蘇木素-伊紅(HE)染色和Masson染色試劑盒購自武漢華美公司(中國)。GRP78、eIF2α和Caspase-12一抗以及相關二抗購自Abcam公司(美國)。PVDF膜(Bio-Rad，美國)。PCR引物由Genewiz(蘇州，中國)設計和合成。逆轉錄試劑盒TaKaRa和SYBR Prellix Ex TaqTM實時PCR試劑盒購自TaKaRa(日本)。

1.2 建模和藥物處理方法

SD大鼠45只隨機分為3組，各15只，即對照組，模型組，茵陳蒿湯組。模型組和茵陳蒿湯組通過白酒-玉米油-吡唑混合液灌胃結合小劑量CCl4腹腔注射建立，CCl4溶解在橄欖油中，體積比為1∶1，注射劑量為0.2 mL/kg體質量，每周2次，連續(xù)8周。建模同時使用茵陳蒿湯灌胃，每次10 mL，連續(xù)灌胃8周。通過HE染色和Masson染色分析建模情況以及茵陳蒿湯干預效果，血生化檢測大鼠肝功能(ALT和AST水平)驗證造模的成功性。

茵陳蒿湯制備方法：茵陳18 g，梔子12 g以及大黃6 g制成水煎劑，減壓濃縮至0.35 g/mL。大鼠茵陳蒿湯使用劑量通過《中藥藥理研究方法學》換算為3.5 g /kg。

1.3 檢測指標和方法

1.3.1HE染色和Masson染色:大鼠麻醉處死后取出肝臟組織，立即使用4%甲醛溶液在室溫下固定24 h。脫水并包埋在石蠟中。將樣品切成5 μm厚的均勻薄片并置于APES涂覆的載玻片上。分別通過HE和Masson試劑進行染色，顯微鏡觀察肝組織形態(tài)和纖維化程度。

1.3.2Western Blot:使用Western Blot檢測肝組織中GRP78、eIF2α和Caspase-12蛋白水平。在液氮的保護下裂解組織細胞，在12 000 r/min，4 ℃下離心15 min收集上清液，使用BCA方法確定蛋白質濃度。使用10%的SDS-PAGE凝膠用于電泳，電泳后使用PVDF膜進行轉膜并在室溫下用5%無脂牛奶封閉2 h。加入一抗室溫震蕩2 h，后在4 ℃孵育過夜，加入二抗。使用GAPDH作為內參。

1.3.3RT-qPCR:RT-qPCR用于檢測肝組織中膠原蛋白Collagen I和Collagen III、TIMP-1、Smad2 mRNA的表達水平。將組織在液氮保護下研磨裂解，然后用Trizol法提取組織總RNA并溶解于DEPC水中。使用逆轉錄試劑盒合成cDNA，反應條件為37℃ 15 min，逆轉錄酶失活條件為85 ℃ 15 s。用實時PCR試劑盒進行RT-qPCR實驗， 95℃ 5 min下激活DNA聚合酶，然后進行40個循環(huán)的兩步PCR(95℃ 10 s和60℃ 30 s)，延伸75 ℃ 10 min，最終保持在4°C。使用2-ΔΔCT法分析mRNA表達。

1.4 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較

8周后對照組大鼠精力充沛、皮毛光滑。模型組大鼠反應遲鈍，皮毛出現(xiàn)明顯脫落，并且腹部出現(xiàn)隆起，部分出現(xiàn)出血。干預組大鼠未出現(xiàn)腹部隆起和出血情況，皮毛較完整光滑，精力較充沛。

2.2 各組大鼠肝組織HE染色和血生化結果比較

對照組大鼠的肝組織中細胞大小均一，形態(tài)完整，細胞以中央靜脈為中心成放射狀排列，肝小葉結構完整、清晰。模型組干細胞出現(xiàn)顯著形變，細胞排列異常，出現(xiàn)假肝小葉，并且出現(xiàn)炎癥反應。茵陳蒿湯組肝組織損傷程度較模型組顯著緩解，炎癥反應較輕，細胞排列基本緊密。這提示模型組肝組織出現(xiàn)顯著的損傷，茵陳蒿湯可顯著緩解肝損傷。見圖1。血生化結果顯示，模型組ALT和AST水平顯著高于對照組(P<0.05)，菌陳蒿湯干預后ALT和AST水平顯著低于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖1 各組大鼠8周后肝組織HE染色結果比較Fig.1 Compariso n of HE staining results of liver tissue in the rats of each group after 8 weeks

圖2 各組大鼠8周后血ALT和AST水平比較注：與對照組比較，##P<0.01;與模型組比較,**P<0.01Fig.2 Comparison of serum ALT and AST levels of the rats in each group after 8 weeksNote:compared with the control group ##P<0.01;compared with the model group **P<0.01

2.3 各組肝組織Masson染色結果比較

對各組大鼠肝組織進行Masson染色，圖3中灰藍色為纖維組織，結果顯示對照組大鼠肝組織未發(fā)現(xiàn)明顯的纖維化現(xiàn)象，而模型組肝組織出現(xiàn)大量的纖維化染色，茵陳蒿湯組肝組織基本正常，并且僅有少量的纖維化染色。這提示大鼠LF模型建立成功，茵陳蒿湯可顯著抑制LF。

2.4 各組Caspase-12通路比較

建模后8周模型組大鼠肝組織中GRP78、eIF2α和Caspase-12顯著升高(P<0.01)，茵陳蒿湯組的GRP78、eIF2α和Caspase-12顯著低于模型組(P<0.01)，見表1和圖4。

表1 各組GRP78、eIF2α和Caspase-12蛋白表達水平比較Table 1 Comparison of GRP78, eIF2α and Caspase-12 protein expression levels in each group

2.5 各組Collagen I、Collagen III、TIMP-1、Smad2 mRNA水平比較

模型組的Collagen I、Collagen III、TIMP-1、Smad2 mRNA和蛋白水平顯著高于對照組(P<0.01)，茵陳蒿湯組Collagen I、Collagen III、TIMP-1、Smad2 mRNA和蛋白水平顯著低于模型組(P<0.01)，見表2和圖5。

圖3 各組大鼠8周后肝組織Masson染色結果比較注：與對照組比較，**P<0.01;與模型組比較,# P<0.01Fig.3 Comparison of Masson staining results of liver tissue in the rats of each group after 8 weeksNote:compared with the control group **P<0.01;compared with the model group # P<0.01

表2 各組Collagen I、Collagen III、TIMP-1、Smad2 mRNA水平比較Table 2 Comparison of mRNA levels of Collagen I, Collagen III, TIMP-1, and Smad2 in each group

圖4 各組GRP78、eIF2α和Caspase-12蛋白表達水平比較Fig.4 Comparison of GRP78, eIF2α and Caspase-12 protein expression leves in each group

圖5 各組Collagen I、Collagen III、TIMP-1、Smad2蛋白水平比較Fig.5 Comparison of protein levels of Collagen I, Collagen III, TIMP-1 and Smad2 in each group

3 討論

LF是肝臟對反復損傷的傷口愈合反應的結果，多種藥物引起的肝損傷會引起LF，此外，慢性病毒性肝炎、酒精毒性、自身免疫性疾病和遺傳性代謝紊亂也會引起LF，肝星狀細胞(HSC)會發(fā)展成肌成纖維細胞樣表型，并過量表達平滑肌肌動蛋白和Collagen I、Collagen III蛋白[5]。LF會影響肝功能和機體的代謝水平，并且LF尚無特異性的治療藥物，探究有效的治療LF的方法具有重要意義。

中藥在治療LF中有著較好的效果，茵陳蒿湯記載于《傷寒論》，具有保肝利膽之功效，有研究顯示茵陳蒿湯在治療肝損傷中有較好的效果[6]，最近也有研究顯示茵陳具有治療LF的作用[7]。本次研究中通過CCl4建立LF模型，并通過HE染色后和Masson染色鑒定建模成功，通過茵陳蒿湯灌胃治療可顯著地減少纖維組織的生成，并保護肝細胞及肝小葉結構，具有較好的保肝作用，這與過往的研究結果相一致[7]。此外，進一步的研究也顯示模型組的Collagen I、Collagen III mRNA水平顯著高于對照組，茵陳蒿湯組Collagen I、Collagen IIImRNA水平顯著低于模型組?；|金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)可以通過調節(jié)基質金屬蛋白酶(MMPs)的活性參與細胞外基質的降解[8]。本次研究結果顯示模型組的TIMP-1 mRNA水平顯著高于對照組，茵陳蒿湯組TIMP-1 mRNA水平顯著低于模型組。這說明茵陳蒿湯可抑制細胞外機制的生成，抑制纖維化進程，并保護肝組織，但是關于其治療機制尚無定論。

有研究認為肝細胞凋亡水平增加是LF過程造成肝損傷的主要因素，細胞凋亡主要有三種通路，即線粒體途徑、死亡受體相關通路和內質網(wǎng)應激相關通路，Caspase-12通路可激活內質網(wǎng)應激途徑引起細胞凋亡，Caspase-12通路的激活被發(fā)現(xiàn)可能是LF的機制之一[9]。本次研究結果顯示模型組ALT和AST水平顯著高于對照組，菌陳蒿湯干預后ALT和AST水平顯著低于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義。該結果表明，菌陳蒿湯可以有效改善模型大鼠的肝功能，符合我們的預期。進一步研究結果顯示，模型組大鼠肝組織中GRP78、eIF2α和Caspase-12顯著升高，茵陳蒿湯組的GRP78、eIF2α和Caspase-12顯著低于模型組。研究認為抑制Caspase-12通路可顯著減少內質網(wǎng)應激途徑減少細胞凋亡[10]。Kim等[11]研究也發(fā)現(xiàn)使用caspase抑制劑可以通過調節(jié)膠質細胞逆轉LF。Smad2可調節(jié)上皮間充質轉化作用，研究已經發(fā)現(xiàn)Smad2是參與LF的發(fā)生和發(fā)展的重要基因[12]。本次研究結果顯示模型組的Smad2 mRNA水平顯著高于對照組，茵陳蒿湯組Smad2 mRNA水平顯著低于模型組。有研究發(fā)現(xiàn)更低水平的TIMP-1具有更好的治療效果[13]。也有研究發(fā)現(xiàn)抑制Smad2可有效地抑制LF[14]。這提示茵陳蒿湯可能通過抑制Caspse-12通路以及Smad2基因的表達抑制肝細胞凋亡和抑制LF，從而發(fā)揮保護肝組織的作用。

綜上所述，茵陳蒿湯可顯著緩解大鼠肝組織的纖維化，這可能由于茵陳蒿湯具有抑制Caspase-12通路以及Smad2基因的表達發(fā)揮抗纖維化和抗凋亡的作用有關。說明茵陳蒿湯對于LF具有較好的治療效果，但是關于其治療LF的劑量、安全性以及機制還需要進一步研究。