馬美玉

摘要：為研究大曲中微生物的組成，分析產(chǎn)果膠酶的特征采取研究的方式，研究瀘州老窖釀酒大曲中微生物的分離鑒定情況。運(yùn)用兩種霉菌測(cè)定酶活篩選出活力最高的霉菌。一直以來(lái)中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的運(yùn)用，廣泛在調(diào)味品行業(yè)、釀酒行業(yè)，在飲食上有非常深厚的影響。白酒釀造的時(shí)候會(huì)以“大曲”為發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵，大曲含有眾多的微生物和酶。但是在目前人們對(duì)酶的認(rèn)識(shí)還極度缺乏，因此對(duì)大曲中產(chǎn)果膠酶微生物的分離鑒定及其產(chǎn)酶活力評(píng)價(jià)研究有很重要的意義。

關(guān)鍵詞：大曲;產(chǎn)果膠酶;微生物;分離鑒定;產(chǎn)酶活力

國(guó)內(nèi)目前對(duì)大曲中的微生物以及所含有的酶系認(rèn)識(shí)還需要加強(qiáng)，由于認(rèn)識(shí)不夠完善和系統(tǒng)，因此在微生物領(lǐng)域還需要加強(qiáng)研究來(lái)補(bǔ)充這個(gè)領(lǐng)域內(nèi)的空白。只有做好研究之后才可以更好的利用大曲，運(yùn)用大曲釀酒是國(guó)內(nèi)的傳統(tǒng)工藝，瀘州老窖是典型白酒的代表，在國(guó)內(nèi)有很重要的地位，由于發(fā)酵工藝和制作工序獨(dú)特老道，因此此酒有獨(dú)特的香氣和口感，研究的時(shí)候從白酒中分離鑒定產(chǎn)果膠酶微生物進(jìn)行系統(tǒng)合理的研究，整理出相關(guān)的筆記為微生物的運(yùn)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)分析

1.1 分離微生物

語(yǔ)言稀釋法和劃線分離的方式從大曲中分離出20株微生物，細(xì)菌15株真菌5株分別做好標(biāo)記，其中真菌中有三株為耐熱均，分離之后的菌保存與80℃的試驗(yàn)內(nèi)以防后續(xù)使用。

1.2 測(cè)定果膠酶

測(cè)定果膠酶酶活，運(yùn)用DNS發(fā)測(cè)定上述菌株中的產(chǎn)果膠酶活力，以標(biāo)準(zhǔn)曲線換算酶活力單位后測(cè)得所有的酶都有產(chǎn)果膠酶的能力，其中有兩株產(chǎn)酶能力高于其他株，分別為一株真菌、一株細(xì)菌。

1.3 高產(chǎn)果膠酶

通過對(duì)產(chǎn)果膠酶能力高的真菌、細(xì)菌分別運(yùn)用ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增得出產(chǎn)物，產(chǎn)物在0.01（%）的瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)之后送Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序得出結(jié)果，對(duì)比真菌和細(xì)菌的最終結(jié)果，最終得出細(xì)菌與鶉雞腸球菌之間的相似度高達(dá)99%，真菌與濕熱子囊菌之間的相似度為百分之百。

1.4 細(xì)菌產(chǎn)果膠酶

在不同的環(huán)境下，PH對(duì)酶的可解離基團(tuán)解離狀態(tài)會(huì)產(chǎn)生很大的影響直到影響酶的催化活性，因此測(cè)定酶的特定PH環(huán)境值，對(duì)酶的合理生產(chǎn)尤為關(guān)鍵。字試驗(yàn)中針對(duì)細(xì)菌的產(chǎn)生的產(chǎn)果膠酶進(jìn)行PH環(huán)境值測(cè)定，最終的結(jié)果表示細(xì)菌可以適應(yīng)對(duì)方PH值為3.0，屬于酸性。除了PH之外溫度的影響也很重要，測(cè)定了細(xì)菌的最適反應(yīng)溫度，測(cè)定出在50℃的時(shí)候酶活性最為活躍，低于50℃的時(shí)候酶活隨著溫度的升高而升高，50℃為巔峰值，超過之后酶活降低。但是在60～70℃之間酶活存在回升的情況。把處于不同PH環(huán)境下的緩沖液進(jìn)行處理之后的產(chǎn)果膠酶放置在30℃的情況下保溫1h，取樣在一定的倍數(shù)下稀釋后測(cè)定酶活，與沒有處理的酶進(jìn)行對(duì)照評(píng)價(jià)PH的穩(wěn)定性。最終結(jié)果顯示細(xì)菌具有良好的穩(wěn)定性，在PH=3、5～11之間酶活力為40%[1]。

將產(chǎn)果膠酶放置在不同的溫度水浴鍋中保溫1h之后取樣，按照一定的倍數(shù)稀釋后在合適的條件下測(cè)定酶活，與100%未處理過的酶液進(jìn)行對(duì)照評(píng)估熱穩(wěn)定性。最終的結(jié)果顯示在30℃～60℃之間熱穩(wěn)定性能良好，再這樣的環(huán)境下保溫1h后酶的剩余酶活力仍舊保持在50%以上。但是超過50℃之后酶活力明顯下降，60℃的時(shí)候酶活力為20%。

2 討論與分析

不同地方的工藝、地域條件等導(dǎo)致大曲中微生物群落的分布存在多樣性，截止到現(xiàn)在為止已經(jīng)有大量關(guān)于大曲中微生物群落分布的研究。目前關(guān)于大曲微生物的研究基本上都是利用組學(xué)分析研究，從瀘州老窖中分離鑒定出的微生物報(bào)道很少，評(píng)估其產(chǎn)果膠酶的能力。其中分離出來(lái)最終具有產(chǎn)果膠酶的為細(xì)菌腸球菌為熱子囊菌。這為微生物在釀酒行業(yè)中發(fā)揮作用奠定了很好的基礎(chǔ)。

3 材料與方法

3.1 材料

大曲。

3.2 培養(yǎng)

細(xì)菌分離采用牛肉膏蛋白膠培養(yǎng)基置于37℃、50℃內(nèi)培養(yǎng)1～2天，PH值為7.0～7.2，真菌分離采用SDAY培養(yǎng)基與30℃、50℃內(nèi)培養(yǎng)2～3天，產(chǎn)酶能力檢測(cè)采用產(chǎn)酶培養(yǎng)基在37℃——細(xì)菌、30℃——真菌內(nèi)，150r/min搖床培養(yǎng)3～4天。

3.3 產(chǎn)果膠酶酶活性檢測(cè)

分別將細(xì)菌備制、真菌備制在特定的環(huán)境內(nèi)。酶活檢測(cè)采用DNS檢測(cè)法測(cè)定，采取繪制標(biāo)準(zhǔn)的曲線。稀釋一定量的半乳糖醛酸后加入DNS試劑，沸水浴15分鐘后冷卻，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)540nm測(cè)定吸光度。粗酶液酶活測(cè)定，放置果膠量為1%，PH環(huán)境3.5，果膠底物0.05mol/L內(nèi)，在50℃內(nèi)水浴保溫10min。按照一定的試劑混合后，將冷卻后的緩沖劑適當(dāng)稀釋在酶標(biāo)儀下測(cè)光吸收值。最適pH值，測(cè)定不同PH處理時(shí)間的不同，考慮產(chǎn)果膠酶的殘余酶活力，考察產(chǎn)果膠酶的穩(wěn)定性。將粗酶液體稀釋一定倍數(shù)之后與最適PH值在30℃、60℃的情況下合理反應(yīng)，分別保存1h后取樣與最適PH果膠底物在適合的溫度下合理反應(yīng)，與尚未進(jìn)行處理的粗酶液100%進(jìn)行對(duì)照，測(cè)量在不同時(shí)間、不同溫度內(nèi)果膠酶的殘余酶活力考察產(chǎn)果膠酶的穩(wěn)定程度[2]。

4 結(jié)語(yǔ)

大曲中有非常豐富的微生物，微生物群落可以產(chǎn)生多樣且復(fù)雜的酶系，進(jìn)行催化膨大之后產(chǎn)生發(fā)酵反應(yīng)，最終釀制成酒。大曲中的酶根據(jù)催化的功能可以分為糖化酶、液化酶、酸性蛋白酶等等，果膠屬于帶負(fù)荷的酸性大分子且廣泛存在與植物細(xì)胞壁中，成為重要的組成部分。本文運(yùn)用試驗(yàn)的方式篩選出細(xì)菌與真菌，對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)分析研究后探索其中微生物產(chǎn)果膠酶的酶學(xué)性質(zhì)。證明了在未來(lái)的發(fā)展中有非常好的潛力。

參考文獻(xiàn)：

[1]徐鵬，王大紅，陳亞欣，等.一株大麻脫膠菌株的分離鑒定及其產(chǎn)果膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].中國(guó)麻業(yè)科學(xué)，2019（3）：122129.

[2]王曉丹，羅小葉，邱樹毅.茅臺(tái)大曲中一株嗜熱放線菌的分離篩選及特性研究[J].中國(guó)釀造，2018（4）：5156.