朱佳 余柯達(dá) 毛佳婷 鄒立波 師帥 劉鴻

隨著我國“全面二孩”政策的開放和初婚年齡的推遲，高齡使不孕不育的問題顯著增加。在不孕不育患者中因男性因素導(dǎo)致的不育幾乎占了一半，對男性的生育力進(jìn)行評估需要進(jìn)行常規(guī)精液分析，其中有15%顯示精液常規(guī)分析指標(biāo)正常，表明僅靠常規(guī)精液分析無法全面評估男性生育力。近年來有大量研究結(jié)果表明精子DNA碎片與男性生育力相關(guān)，Zini等［1］發(fā)現(xiàn)不育男性的精子DNA碎片指數(shù)（DFI）顯著高于正常男性。有研究者發(fā)現(xiàn)當(dāng)精子DFI＞30%時，宮腔內(nèi)人工授精的妊娠率顯著降低［2-3］。精子DFI對IVF/ICSI結(jié)局的影響，研究結(jié)果表明其和受精率、胚胎發(fā)育、著床率與妊娠率等具有顯著的負(fù)相關(guān)性［4-5］。因此檢測精子DFI對評估不育男性生育力具有重要意義。本研究測定了316例男性不育癥患者的精子DFI、精液體積、液化時間、精子濃度、前向運動率和正常形態(tài)率等參數(shù)，分析了不育男性精子DFI與年齡及精液常規(guī)參數(shù)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年1月至12月在本院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的不育癥男性患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）夫妻正常性生活＞1年不育；（2）男方體檢未發(fā)現(xiàn)明顯睪丸、附睪及輸精管異常；（3）無遺傳性疾病家族史；（4）女方輸卵管通暢，無生育能力異常。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 方法 所有患者禁欲3～7d后通過手淫法取精，將全部精液置于無菌取精杯中，并置于37℃的水浴箱中進(jìn)行液化，完全液化后利用CASA分析精子濃度和前向運動率，采用Diff-Quik染色法和精子染色質(zhì)擴(kuò)散實驗（SCD）分別檢測精子形態(tài)和精子DFI。SCD結(jié)果判斷：計數(shù)500個精子，觀察精子光暈大小，根據(jù)光暈與精子頭部橫徑的比例，分為大、中、小和無光暈4個級別。大和中光暈表示精子DNA完整無碎片，小和無光暈表示精子DNA斷裂為碎片。精子DFI的值為小和無光暈精子數(shù)/精子總數(shù)。小光暈≤精子頭直徑1/4，中光暈＞精子頭直徑1/4卻≤精子頭直徑2/3，大光暈＞精子頭直徑2/3。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對不育男性精子DFI與年齡、精液體積、液化時間、精子濃度、前向運動率和正常形態(tài)率的相關(guān)性進(jìn)行分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

符合納入條件的有316例不育癥男性患者，對其精液進(jìn)行精子DFI 檢測，按結(jié)果分成3組：精子核 DNA完整性正常組（DFI＜10%，圖1A，201例，占63.61%）、精子核DNA完整性輕度異常組（10%≤DFI＜20%，圖1B，79例，占25.00%）和精子核DNA完整性重度異常組（DFI≥20%，圖1C，36例，占11.39%）。

圖1 光學(xué)顯微鏡下SCD實驗結(jié)果（A：DFI＜10%；B：10%≤DFI＜20%；C：DFI ≥20%。1、2、3和4分別為大、中、小和無光暈精子）

2.1 不育男性精子DFI與年齡的相關(guān)性 根據(jù)不育男性的年齡分成≤30歲、31～40歲和≥41歲三組，根據(jù)表1可知，在DFI＜10%中，年齡≤30歲組的比例高達(dá)80.37%，顯著高于31～40歲組和≥41歲組的 60.36% 和 32.50%（P＜0.05），同時 31～40歲組顯著高于≥41歲組（P＜0.05）。在10%≤DFI＜20%中，年齡≤30歲組的比例顯著低于31～40歲組和≥41歲組（P＜0.05），且 31～40歲組顯著低于≥ 41歲組（P＜0.05）。在DFI≥20%中，其比例隨年齡變化趨勢與10%≤DFI＜20%一致。

表1 不育男性年齡與精子DFI的相關(guān)性［n（%）］

2.2 不育男性精子DFI與精液常規(guī)參數(shù)的相關(guān)性 根據(jù)精液體積將患者分成＜1.5ml和≥1.5ml 兩組，兩組之間 DFI＜10%、10% ≤ DFI＜20% 和 DFI≥ 20% 的患者比例無顯著差異性（P＞0.05）。液化時間＜30min和≥30min之間三組DFI的患者比例變化與精液體積一致，無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。根據(jù)精子濃度將患者分成 ＜50×106/ml和≥ 50×106/ml兩組，＜50×106/ml中DFI＜10% 的患者比例顯著低于≥ 50×106/ml（P＜0.05），10%≤DFI＜20%和DFI≥20%的比例則顯著高于≥50×106/ml（P＜0.05）。根據(jù)前向運動率（正常形態(tài)率）將患者分成＜32%和≥32%（＜4%和≥4%）兩組，兩組之間DFI的患者比例變化與精子濃度一致，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。見表2。

表2 不育男性精液參數(shù)與精子DFI的相關(guān)性［n（%）］

3 討論

精子DNA的完整性是父代遺傳信息得以準(zhǔn)確傳遞的必要條件。關(guān)于精子DNA碎片化的具體發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚，目前學(xué)者們認(rèn)為氧化應(yīng)激、凋亡異常和染色質(zhì)組裝異常是DNA發(fā)生碎片化的主要機(jī)制［6］。氧化應(yīng)激：正常情況下，體內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生和清除處于平衡狀態(tài)，若受到有害刺激因素或其他條件的限制時，則會使平衡受到破壞，機(jī)體進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)，過量的ROS會導(dǎo)致精子DNA損傷。凋亡異常：凋亡調(diào)控著精子在數(shù)量、形態(tài)和功能上的平衡，若凋亡發(fā)生異常，不能清除DNA受損的精子，使其比例大幅度上升。染色質(zhì)組裝異常：精子核染色質(zhì)的組裝過程容易受到有害因素干擾而出現(xiàn)異常，導(dǎo)致精子DNA雙鏈碎片的產(chǎn)生和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞。目前用于精子DFI檢測的方法較多，相較于精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析試驗、彗星實驗和熒光原位雜交等，SCD是一種簡便易行、費用低、敏感的檢測精子DNA損傷的檢測方法。

關(guān)于不育男性精子DFI與年齡之間的相關(guān)性，多數(shù)研究者認(rèn)為隨著不育男性年齡的增加，其精子DFI顯著升高［7-8］。本研究的結(jié)果與上述結(jié)論相一致。正常情況下人體內(nèi)的氧化體系和抗氧化體系之間保持著相對平衡狀態(tài)，但隨著年齡增加，男性的生殖系統(tǒng)逐漸老化，ROS產(chǎn)生和清除之間的平衡就被破壞，導(dǎo)致ROS增多，造成精子DNA鏈斷裂，從而使精液中的精子 DFI升高［6］。

精液體積、液化時間、精子濃度、前向運動率和正常形態(tài)率是精液質(zhì)量常規(guī)分析中的重要指標(biāo)，本研究結(jié)果表明精子DFI 與精液體積、液化時間之間無顯著相關(guān)性（P＞0.05），與精子濃度、前向運動率和正常形態(tài)率之間呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。過多的ROS會導(dǎo)致精子DNA損傷，并誘導(dǎo)含脂質(zhì)的精子質(zhì)膜過氧化，從而導(dǎo)致精子的結(jié)構(gòu)和功能損傷，還會通過破壞精子軸絲結(jié)構(gòu)和減少三磷酸腺苷含量來損害精子的運動能力［9］，因此導(dǎo)致精子DFI與前向運動率呈顯著負(fù)相關(guān)。同時染色質(zhì)被ROS重度損傷的精子會提早進(jìn)入細(xì)胞凋亡階段［10］，因此導(dǎo)致精子DFI也與精子濃度呈負(fù)相關(guān)。精子形態(tài)中的頭部是染色質(zhì)凝聚程度的外在表現(xiàn)，是根據(jù)細(xì)胞核中染色質(zhì)凝聚過程中DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體特殊的組裝方式?jīng)Q定的［11］，因此精子DFI和正常形態(tài)率負(fù)相關(guān)的原因可能是精子DNA損傷導(dǎo)致精子染色體結(jié)構(gòu)受損。綜上所述，精子DFI在反映精子 DNA 損傷程度的同時也反映了精子濃度、活力及其形態(tài)，因此可作為評價男性精液質(zhì)量和生育力的重要指標(biāo)之一。