馮璐燕 賴尚磊 葉螢燕 張漪婷 竇曉兵 李松濤

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種以肝臟脂肪過量積聚為主要病理特征的疾病，其臨床表現(xiàn)形式包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎，疾病可遞進(jìn)發(fā)展為肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌等中末端肝?。?-2］。近年來伴隨人們生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變，NAFLD 在我國的患病率逐年增加，我國NAFLD的患病率從2013年報(bào)道的20.9%，增加至2018年的25%以上［3-4］。在NAFLD的治療中祖國醫(yī)學(xué)的療效具有明顯優(yōu)勢，采用中醫(yī)藥物治療 NAFLD可減少肝臟脂肪沉積、改善脂質(zhì)代謝紊亂及肝功能［5］。中藥單體化合物齊墩果酸（oleanolic acid，OLA）主要來源于女貞子，《本草再新》中論述女貞子具有“養(yǎng)陰益腎、補(bǔ)氣舒肝”的功效，楊念云等［6］研究發(fā)現(xiàn)女貞子可顯著改善高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD。研究表明OLA具有調(diào)血脂、抗脂肪肝等功效［7］，但其作用機(jī)制尚不明確，因此，本研究以棕櫚酸（palmitic acid，PA）誘導(dǎo)Aml-12肝細(xì)胞建立肝細(xì)胞脂毒性模型，探究OLA對PA誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂毒性的保護(hù)作用及潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器 Aml-12小鼠正常肝細(xì)胞株購自中國科學(xué)院（上海）細(xì)胞庫；PA、雷帕霉素（rapamycin，Rap）、氯喹（chloroquine，CQ）、OLA、DMEM/F12 培養(yǎng)基購自Sigma公司；胎牛血清購自Gibco公司；抗LC3B及抗GAPDH抗體購自Cell Signaling公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo，USA）；酶標(biāo)儀（MD，USA）；AllegraTM 64R低溫高速離心機(jī)（Beckman，USA）；數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)（Protein Simple，USA）。

1.2 方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)：Aml-12細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM/F-12培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、5mg/ml胰島素，5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，5ng/ml硒，40ng/ml地塞米松）于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。（2）細(xì)胞干預(yù)：OLA不同濃度（10、20、40、80、100μmol/L）干預(yù)細(xì)胞24h后檢測細(xì)胞活力。OLA保護(hù)脂毒性實(shí)驗(yàn)中使用OLA干預(yù)2h后加入PA處理12h，收集培養(yǎng)基或細(xì)胞便于進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。自噬激動(dòng)或抑制分別采用自噬激動(dòng)劑Rap（100nmol/L）或自噬抑制劑CQ（20μmol/L）對細(xì)胞預(yù)處理1h后給予其他干預(yù)。（3）PA制備：將棕櫚酸溶解在乙醇中并用氫氧化鈉皂化。將鈉鹽干燥，重新懸浮在PBS中并在80℃下加熱直至其完全溶解。當(dāng)溶液仍然溫?zé)釙r(shí)，加入等體積的20%BSA，將混合物在50℃攪拌4h，使棕櫚酸與BSA結(jié)合。然后通過使用0.2μm直徑的過濾器過濾將棕櫚酸-BSA（3mmol/L棕櫚酸：1.5mmol/L BSA；摩爾比，2：1）除菌，并分裝以備使用。（4）細(xì)胞死亡檢測：乳酸脫氫酶（LDH）在培養(yǎng)液中的釋放、Hoechst染色和MTT試驗(yàn)。對乳酸脫氫酶測定，收集培養(yǎng)基，用乳酸脫氫酶檢測試劑盒（Thermo Scientific Inc，VA），按照制造商的說明指示，Hoechst染色用Hoechst 33342染色液（5mg/L）染色10min。PBS漂洗后，用熒光顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行成像（Leica，Whitzlar，德國）。MTT法將細(xì)胞接種于96孔板中，密度為2×104/孔，培養(yǎng)至80%匯合。每孔分別加入20μl［3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四氮唑，5mg/ml］。細(xì)胞在37℃下孵育4h，使MTT摻入并轉(zhuǎn)化為甲醛衍生物。二甲亞砜（DMSO）對甲醛衍生物有一定的增溶作用。在室溫下?lián)u床孵育10min后，用FLUOSTAR Omega在470nm處測定吸光度值（BMG LabTech，Offenburg，德國）。（5）Western Blot：收集細(xì)胞，用PBS漂洗，加適量蛋白裂解液，放冰上30min，充分渦旋震蕩后，于4℃ 12000g離心15min，收集蛋白上清液，用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。加入上樣緩沖液，100℃煮5min使蛋白變性，冷卻后上樣。每個(gè)樣品取等量蛋白用SDS-PAGE電泳分離后，低溫轉(zhuǎn)移至PVDF膜，含5% BSA封閉液封閉，與相應(yīng)的一抗、二抗雜交，用化學(xué)發(fā)光法及數(shù)字凝膠成像儀對圖像進(jìn)行拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。對多組不同處理方式的樣本，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)采用one-way ANOVA方法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞脂毒性模型建立 如圖1A所示，給予Aml-12小鼠肝細(xì)胞不同濃度的PA進(jìn)行干預(yù)，細(xì)胞釋放的LDH水平顯著增加（P＜0.05），并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，說明肝細(xì)胞損傷顯著增強(qiáng)。Hoechst染色結(jié)果表明PA干預(yù)以劑量依賴關(guān)系增加肝細(xì)胞的細(xì)胞核損傷（圖1B）。上述結(jié)果說明PA可以劑量依賴關(guān)系誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂毒性，在后續(xù)研究中選擇0.5mmol/L的PA作為脂毒性誘導(dǎo)劑量。

圖1 不同濃度PA對Aml-12細(xì)胞脂毒性的影響（注：A：PA干預(yù)后細(xì)胞上清LDH含量檢測；B：Hoechst染色觀察PA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷）

2.2 OLA改善PA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂毒性 給予Aml-12細(xì) 胞 不 同 濃 度 劑 量 的 OLA（10、20、40、80、100μmol/L）處理24h后，通過MTT法檢測細(xì)胞活力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)OLA濃度＞80μmol/L呈現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性（P＜0.05，圖2A）。因此，選擇≤40μmol/L的OLA濃度進(jìn)行后續(xù)研究。研究結(jié)果表明OLA干預(yù)可顯著抑制PA（0.5mmol/L）誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷（P＜0.05），并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系（圖2B、C）。

圖2 OLA改善PA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂毒性［注：A：MTT法細(xì)胞活力檢測細(xì)胞；B：培養(yǎng)液上清LDH含量檢測；C：Hoechst染色觀察（400×）］

2.3 自噬調(diào)控PA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂毒性 分別采用自噬抑制劑CQ（20μmol/L）和自噬激動(dòng)劑Rapamycin（100 nmol/L）對Aml-12細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理1h，然后給予細(xì)胞PA處理12h，檢測自噬抑制或激活自噬對PA誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的影響，結(jié)果表明抑制自噬可顯著加重PA誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，而激活自噬能顯著改善細(xì)胞損傷情況（P＜0.05，圖3A）。通過Hoechst染色觀察得到與上述一致的結(jié)果，即抑制自噬顯著加重了PA處理導(dǎo)致的胞內(nèi)細(xì)胞核固縮及核小體碎片增加；而激活自噬后細(xì)胞核損傷明顯改善（圖3B）。

圖3 自噬調(diào)控PA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂毒性［注：A：細(xì)胞上清LDH含量檢測；B：Hoechst染色觀察（400×）］

2.4 OLA通過激活自噬改善PA誘導(dǎo)的脂毒性 隨后檢測了OLA對肝細(xì)胞自噬的影響，分別以10、20和40μmol/L的OLA處理Aml-12肝細(xì)胞12h，通過Western blot檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3B Ⅰ/Ⅱ的表達(dá)變化，結(jié)果表明OLA能以劑量依賴關(guān)系激活LC3 Ⅱ的表達(dá)（P＜0.05，圖4A），說明OLA可顯著激活肝細(xì)胞自噬。給予Aml-12細(xì)胞自噬抑制劑CQ（20μmol/L）預(yù)處理1h后再給予OLA（40μmol/L）干預(yù)2h，隨后進(jìn)行PA處理12h，結(jié)果表明抑制自噬顯著阻斷了OLA對PA誘導(dǎo)脂毒性的保護(hù)作用（P＜0.05，圖4B）。Hoechst染色觀察結(jié)果一致（圖4C）。上述結(jié)果提示自噬信號通路參與了OLA對PA誘導(dǎo)的脂毒性的保護(hù)作用。

圖4 抑制自噬抑制了OLA對PA誘導(dǎo)脂毒性的保護(hù)作用［注：A：Western blot測定LC3B Ⅰ/Ⅱ的蛋白表達(dá)；B：上清LDH含量檢測；C：Hoechst染色觀察（400×）］

2.5 OLA通過激活A(yù)MPK磷酸化激活自噬 現(xiàn)有研究表明AMPK的激活參與自噬的正向調(diào)控。為驗(yàn)證AMPK是否參與OLA激活自噬對脂毒性的保護(hù)作用，分別以10、20和40μmol/L的OLA處理Aml-12肝細(xì)胞12h，通過Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)AMPK磷酸化水平，結(jié)果表明OLA以劑量依賴關(guān)系激活A(yù)MPK的磷酸化（P＜0.05，圖5A）。分別使用AMPK化學(xué)抑制劑（compound C，1μmol/L）或AMPK siRNA 對AMPK進(jìn)行抑制，結(jié)果表明抑制AMPK可顯著阻斷OLA對脂毒性的緩解作用（P＜0.05，圖5B、C）。

圖5 OLA通過激活A(yù)MPK磷酸化緩解脂毒性（注：A：Western blot測定磷酸化AMPK、AMPK的蛋白表達(dá)；B&C：LDH含量檢測）

3 討論

本研究證實(shí)OLA對PA誘導(dǎo)的Aml-12細(xì)胞脂毒性具有保護(hù)作用，結(jié)果表明OLA通過激活自噬發(fā)揮其有益作用。進(jìn)一步研究表明AMPK信號通路參與了OLA對脂毒性的保護(hù)作用。

NAFLD已成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。近年來中醫(yī)藥在防治NAFLD 已經(jīng)取得了較好的效果。NAFLD在歷代典籍中已有記載，并根據(jù)臨床表現(xiàn)總結(jié)出該病“脅痛”、“痞滿”、“積聚”、“肝癖（痞）”等病因病機(jī)。何道同等［8］認(rèn)為，肝脾功能失常是脂肪肝發(fā)病的始動(dòng)因素［8］。有研究將NAFLD病因病機(jī)歸納為飲食失調(diào)、肝郁氣滯、肝失疏泄［9］。NAFLD病機(jī)可簡要概括為“痰瘀互阻、脂濁積聚、肝絡(luò)不和”。而女貞子具有補(bǔ)氣舒肝之功效，已有研究表明女貞子可顯著改善高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD［7］，而OLA是女貞子的主要成分，研究顯示OLA顯著抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖［10］，也能夠保護(hù)由果糖誘導(dǎo)的NAFLD［11］。但是其機(jī)制并不清楚，尤其是對脂毒性的改善作用不明確，本研究通過PA誘導(dǎo)肝細(xì)胞建立肝細(xì)胞脂毒性模型，使用OLA進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示OLA能夠以劑量依賴關(guān)系改善PA誘導(dǎo)的Aml12肝細(xì)胞脂毒性的作用。

自噬是一種重要的分解代謝程序，用于處理各種大分子細(xì)胞內(nèi)容，包括蛋白質(zhì)聚集體、功能失調(diào)的亞細(xì)胞器，以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。當(dāng)非脂肪細(xì)胞脂質(zhì)過度沉積，機(jī)體可通過脂肪代謝產(chǎn)物、氧化應(yīng)激等途徑激活自噬，以保護(hù)非脂肪組織免受脂毒性損害［12］，因此增強(qiáng)自噬是治療非酒精性脂肪性肝病、代謝綜合征等相關(guān)疾病的新途徑，作者前期發(fā)現(xiàn)激活自噬可以保護(hù)脂毒性誘導(dǎo)的肝損傷［13］，在本研究中證實(shí)了這個(gè)結(jié)論。更重要的是作者發(fā)現(xiàn)了OLA可以激活自噬，檢測了OLA對Aml12肝細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，OLA是自噬的強(qiáng)誘導(dǎo)劑，觀察到OLA作用后導(dǎo)致自噬標(biāo)志蛋白LC3B的表達(dá)顯著增加，且抑制自噬可阻斷OLA的保護(hù)作用，說明OLA通過激活自噬發(fā)揮脂毒性保護(hù)作用。

目前OLA如何激活自噬的分子機(jī)制尚不清楚，研究表明AMPK是自噬的上游調(diào)控分子，而Matumba等［14］研究表明OLA可顯著激活A(yù)MPK，因此，推測OLA可激活A(yù)MPK并發(fā)揮脂毒性保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，OLA能過激活A(yù)MPK的磷酸化，但結(jié)果表明抑制AMPK并不能完全抑制OLA對脂毒性的保護(hù)作用，說明還有其他分子信號通路參與該保護(hù)作用，需要后續(xù)深入研究。