沈曉東 張?zhí)?邊濤

結(jié)直腸癌是全世界第3大高發(fā)惡性腫瘤，每年新診斷病例高達(dá)1200萬［1］，在惡性腫瘤中病死率在全世界居第4位［2］。大量研究表明，WNT信號通路中β-catenin 及c-Myc等活性升高是大多數(shù)結(jié)直腸腺瘤癌變及結(jié)直腸癌形成及進(jìn)展的重要特征［3-4］，其發(fā)病機(jī)制與MYC等原癌基因及APC等抑癌基因發(fā)生突變有關(guān)［4］，c-MYC是這些信號通路最重要的癌基因之一［5］。ApcΔ716/+小鼠模型具備典型的息肉-腺瘤-癌變過程，并且有與人類高度同源性、遺傳性強(qiáng)、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，是國際公認(rèn)的研究結(jié)直腸腺瘤癌變及結(jié)直腸癌的小鼠模型［6］。熱休克蛋白作為分子伴侶與發(fā)生變性的蛋白結(jié)合而維持其正常的結(jié)構(gòu)和功能，可分為HSP90、HSP70、小分子HSP等，其中HSP90在很多惡性腫瘤中表達(dá)明顯升高，并且在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及免疫反應(yīng)中起著重要的作用［7］。本研究采用ApcΔ716/+小鼠，研究腸道腺瘤癌變組織中HSP90及c-Myc的表達(dá)情況及相關(guān)性，為HSP90應(yīng)用于預(yù)防腸道腺瘤癌變提供重要的理論依據(jù)。

1 實驗方法

1.1 材料 HSP90鼠抗人單克隆抗體（ab13492）由艾博抗公司提供，c-Myc鼠抗人單克隆抗體（sc-40）圣克魯斯生物技術(shù)公司提供，ECL發(fā)光試劑盒由阿默舍姆制藥生物技術(shù)公司提供，標(biāo)第一鏈合成系統(tǒng)Ⅱ由賽默飛生命科學(xué)公司提供，其他試劑均為實驗用。

1.2 方法 （1）動物：ApcΔ716/+小鼠由Oshima教授饋贈，小鼠繁殖及擴(kuò)增在SPF環(huán)境中，ApcΔ716/+雄性小鼠及野生型雌性小鼠進(jìn)行交配擴(kuò)增，剪取尾尖基因鑒定，選出ApcΔ716/+小鼠作為本實驗用。（2）腸道腺瘤癌變的判定：通過對2～12周ApcΔ716/+小鼠腸道標(biāo)本進(jìn)行體視顯微鏡以及HE染色檢測發(fā)現(xiàn)，4周開始出現(xiàn)腸道腺瘤，5～7周小鼠腸道腺瘤均為良性；8周時腺瘤開始出現(xiàn)癌變，癌變數(shù)為1～3枚/只，腺瘤癌變與大小有直接相關(guān)，故選取8周最大的腸息肉作為癌變的息肉（同時切取小部分HE染色證明其已經(jīng)發(fā)生癌變），選取5周的1.0mm腸道良性腺瘤作為對照。

1.3 Western blot法檢測腺瘤癌變組織中HSP90及c-Myc的表達(dá) 通過體視顯微鏡采取5周正常黏膜、良性腺瘤及8周癌變息肉，細(xì)胞提取物通過10% SDSPAGE凝膠電泳分離及半干式轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜，第一抗體選用鼠抗人HSP90及c-Myc抗體，滴加二抗，ECL發(fā)光試劑檢測結(jié)果。

1.4 腺瘤癌變組織中HSP90及c-Myc免疫組織化學(xué)染色 選取5周及8周小鼠各8只，處死后分離腸道，福爾馬林固定，石蠟包埋，5μm切片，通過HE染色明確腺瘤癌變部位；滴加HSP90或c-Myc單克隆抗體，4℃冰箱密封過夜，滴加二抗，溫育30min后DAB顯色。染色陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：棕黃色顆粒沉積的部位為染色陽性，腫瘤細(xì)胞c-Myc全部為細(xì)胞核著色，HSP90則絕大部分細(xì)胞核染色，少部分腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)輕微著色。HSP90及c-Myc蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量由染色細(xì)胞比率及著色強(qiáng)度的乘積來判定，由兩名專業(yè)人員雙盲下評分。

1.5 RT-PCR法檢測腺瘤癌變組織中HSP90及c-Myc的 mRNA 選取5周及8周ApcΔ716/+小鼠各16只，處死小鼠后，無RNA酶條件下分離出整個腸道，體視顯微鏡下切取5周小鼠良性腺瘤及8周癌變的息肉，Trizol 試劑盒提取總RNA，標(biāo)第一鏈合成系統(tǒng)Ⅱ試劑盒合成Hsp90及c-Myc的cDNA，Hsp90及c-Myc的引物應(yīng)用ABI PRISM引物設(shè)計軟件確定，PCR擴(kuò)增后使用ABI PRISM? 7000 型序列檢測系統(tǒng)檢測PCR反應(yīng)結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用t檢驗或方差分析檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ApcΔ716/+小鼠腸道腺瘤癌變情況 4周開始出現(xiàn)腸道腺瘤，5周腺瘤總數(shù)為（7.6±3.1）個，均為良性腺瘤；8周小鼠腸道息肉總數(shù)為（68.8±12.8）個/只，其中出現(xiàn)癌變者（1.7±1.1）個/只，惡變與體積大小相關(guān)，體積較大者首先開始癌變。

2.2 腸道腺瘤癌變組織中的HSP90及c-Myc蛋白表達(dá) 通過蛋白電泳發(fā)現(xiàn)，正常腸黏膜HSP90及c-Myc表達(dá)量低，條帶顯示淡；5周時腺瘤內(nèi)HSP90及c-Myc表達(dá)量升高，8周腺瘤癌變組織中HSP90及c-Myc蛋白條帶明顯增強(qiáng)，與良性腺瘤比較比較明顯不同，見圖1。

圖1 HSP90及c-Myc在腸道腺瘤及腺瘤癌變組織中的表達(dá)

2.3 腸道腺瘤癌變組織中HSP90及c-Myc免疫組織化學(xué)染色 腺瘤癌變組織中HSP90染色陽性細(xì)胞明顯增多，染色增強(qiáng)，絕大部分位于細(xì)胞核內(nèi)，少部分位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，其相對表達(dá)量為（6.91±1.19），較良性腺瘤（1.70±0.61）顯著升高（t=-11.038，P＜0.001）；c-Myc免疫組織化學(xué)染色結(jié)果與HSP90相似，腺瘤癌變組織中c-Myc表達(dá)也明顯增多，主要位于細(xì)胞核內(nèi)，其相對表達(dá)量為（7.31±1.22），較良性腺瘤（2.14±0.80）也顯著升高（t=-9.722，P＜0.001），見圖2。

2.4 腸道腺瘤及腺瘤癌變組織中HSP90及c-Myc的mRNA表達(dá) 腺瘤癌變組織中HSP90 mRNA表達(dá)量為（0.62±0.08），較良性腺瘤（0.21±0.06）明顯升高（t=-17.246，P＜0.001）；腺瘤癌變組織中 c-Myc的mRNA表達(dá)量為（0.95±0.10），也較良性腺瘤（0.31±0.05）明顯升高（t=-23.917，P＜0.001）。

2.5 腸道腺瘤癌變組織中HSP90及c-Myc表達(dá)的相關(guān)性 將腺瘤癌變組織中HSP90及c-Myc的mRNA相對值等結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示HSP90及c-Myc的mRNA表達(dá)存在明顯的正相關(guān)（r=0.710，P=0.002）。同樣，對免疫組織化學(xué)染色中HSP90及c-Myc的相對表達(dá)量相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果與mRNA相對值相似（r=0.925，P=0.001）。

圖2 腸道腺瘤及腺瘤癌變組織中HSP90及c-Myc免疫組織化學(xué)染色

3 討論

目前HSP90在腫瘤方面研究日益深入，HSP90不僅在多種惡性腫瘤免疫治療中起到重要的作用，血漿HSP90還可作為腫瘤標(biāo)志物用于許多惡性腫瘤的診斷，HSP90-多肽復(fù)合物對胃腸道惡性腫瘤具有明確的抗腫瘤活性，并已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗階段，故HSP90適合作為腸道腺瘤癌變及結(jié)直腸癌免疫治療的靶點(diǎn)而進(jìn)一步深入研究。

原癌基因MYC突變后，其編碼的蛋白c-Myc可以介導(dǎo)生物信號由細(xì)胞外轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞核內(nèi)，在腫瘤的形成及發(fā)展中起到重要的作用；大量研究表明c-Myc在腸道腺瘤形成及癌變中起到重要作用［8］；HSP90則通過c-Myc 參與很多惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程［9］；本研究通過檢測HSP90及c-Myc在ApcΔ716/+小鼠腸道腺瘤癌變組織中的表達(dá)及相關(guān)性，推測HSP90在腸道腺瘤癌變中的作用機(jī)制，為防治腸道腺瘤癌變提供新選擇。

本實驗中，在8周左右ApcΔ716/+小鼠腺瘤剛開始出現(xiàn)癌變，通過蛋白電泳、免疫組織化學(xué)染色及RT-PCR等實驗方法證明，腺瘤出現(xiàn)癌變時，無論在mRNA水平還是在蛋白質(zhì)水平HSP90及c-Myc均較良性腺瘤時顯著升高；并且腺瘤癌變組織中，HSP90與c-Myc的mRNA表達(dá)及蛋白質(zhì)表達(dá)均具有明顯相關(guān)性，說明HSP90可能通過與c-Myc相互作用，參與腸道腺瘤癌變的調(diào)控。

HSP90參與腸道腺瘤癌變的機(jī)制目前尚不明確，Poole教授等［9］研究表明Myc-HSP90軸是維持許多惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展的關(guān)鍵，本實驗研究結(jié)果與Poole教授的研究結(jié)果相似，HSP90及c-Myc在腸道腺瘤癌變組織中顯著升高并具有相關(guān)性，提示HSP90可能通過c-Myc參與腸道腺瘤癌變，其作用機(jī)制可能有以下幾個方面：（1）HSP90作為分子伴侶維持c-Myc正常構(gòu)象及功能，促進(jìn)腫瘤惡變，這可能是主要機(jī)制；（2）HSP90通過表觀遺傳過程參與c-Myc的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，促進(jìn)c-Myc的轉(zhuǎn)錄及翻譯，提高c-Myc表達(dá)水平；（3）HSP90通過與一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，提高c-Myc的mRNA穩(wěn)定性。但現(xiàn)階段HSP90與c-Myc間具體信號通路尚不完全清楚，需要進(jìn)一步研究明確HSP90 促進(jìn)腸道腺瘤癌變的具體機(jī)制。

本研究中，在8周ApcΔ716/+小鼠腸道腺瘤開始出現(xiàn)癌變時，腺瘤癌變組織中HSP90及c-Myc的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均較良性腺瘤顯著升高，并且HSP90及c-Myc的表達(dá)具有明顯相關(guān)性，提示HSP90通過c-Myc參與腸道腺瘤癌變。本研究探索了HSP90在腸道腺瘤癌變中表達(dá)的及作用機(jī)制，為預(yù)防腸道腺瘤癌變提供新策略。