葉嵐　王銀龍　陳玉成　袁紅春　殷保藏　徐建光

[摘要]目的：觀察異種牙本質(zhì)修復(fù)兔顱骨骨缺損的療效，探索其作為骨移植替代材料的有效性。方法：將因正畸原因拔除的人健康前磨牙，制成直徑2～3mm的牙本質(zhì)塊。在1%氯己定中浸泡5min。使用12只雄性健康新西蘭大白兔，在顱骨各建立4個(gè)臨界骨缺損，將自體骨、人牙本質(zhì)隨機(jī)填入骨缺損區(qū)，術(shù)后4、8、12周隨機(jī)處死4只兔子，取出顱骨，通過(guò)大體觀察、Micro-CT及組織學(xué)觀察顱骨缺損修復(fù)情況，使用Micro-CT分析每個(gè)時(shí)間點(diǎn)新骨形成面積占骨缺損總面積百分比。結(jié)果：所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傷口愈合良好，未見明顯炎癥反應(yīng)。經(jīng)影像學(xué)評(píng)估，自體骨比異種牙本質(zhì)成骨量相似，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。組織學(xué)染色示：圍繞在移植材料周圍，可見新骨形成。結(jié)論：異種牙本質(zhì)能促進(jìn)和加速骨缺損的修復(fù)，有望為促進(jìn)骨缺損的修復(fù)提供一種新思路。

[關(guān)鍵詞]異種牙本質(zhì);骨缺損;兔顱骨缺損模型;新生骨;自體骨移植;Micro-CT

[中圖分類號(hào)]R622? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2020）02-0082-03

Abstract： Objective? To investigate the effect of repairing skull defect with heterogeneous dentin in rabbits and the possibility as bone graft substitutes. Methods? Dentin blocks were prepared from human premolars that were extracted for orthodontic reasons. Dentin was processed into finer chips 2-3mm in diameter. The processed dentin was cleaned by socking them in 1% chlorhexidine for 5minutes.Bony defects were created on the heads of 12 male healthy NewZealand White rabbits. Four bony defects were created in each skull and randomly grafted with either human dentin blocks（experimental group） or autogenous bone grafts（control group）.Rabbits were sacrificed at 4、8 and 12 weeks. The general condition of rabbit was observed after operation， and bone defect repair was evaluated by Micro-CT at 4， 8 and 12 weeks. Then the tissue of defect area was harvested for histological staining to observe defect repair. Results? All animals survived to the end of experiment， and no incision infection occurred during repair process. Micro-CT demonstrated that the new bone volume were similar in the experimental group and the control group， and the difference was not statistically significant （P>0.05）. The observation of histology staining indicated that the surface of the grafted materials were covered with new bone. Conclusion? Heterogeneous dentin accelerated bone regeneration and augmentation. These resultes suggested that heterogeneous dentin provided potential as a bone graft resource during the bone healing process.

Key words： heterogeneous dentin; bone defect; rabbit skull defect model; new bone; autogenous bone transplantation; Micro-CT

因機(jī)械外傷、腫瘤切除、感染、生理性吸收、先天性畸形等因素造成頜骨缺損骨量不足在臨床上很常見，成為制約種植技術(shù)發(fā)展和種植成功的重要原因[1]。因此如何增加骨缺損區(qū)的骨量是擴(kuò)大種植牙適應(yīng)證的關(guān)鍵因素。自體骨材料因其來(lái)源于自體，無(wú)免疫原性，植入后與宿主組織無(wú)免疫排異反應(yīng)，而且具備骨移植材料的三大特性，包括骨生成性，骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性[2]，中等至嚴(yán)重的頜骨缺損自體骨移植技術(shù)被認(rèn)為是可靠的和可預(yù)測(cè)的，因此認(rèn)為自體骨是骨移植材料的金標(biāo)準(zhǔn)[3]。雖然自體骨移植有很多優(yōu)點(diǎn)，但諸如患者不接受在第二術(shù)區(qū)（髂嵴，頦部）取骨所帶來(lái)的額外手術(shù)創(chuàng)傷、疼痛、出血及感染等;且受供區(qū)限制，取骨量少等缺點(diǎn)限制了自體骨的臨床應(yīng)用[4]。因此，研究骨缺損修復(fù)材料具有重要意義。牙本質(zhì)其物質(zhì)組成及理化特性與骨組織相似[5-6]，使用牙本質(zhì)修復(fù)兔顱骨骨缺損，以觀察其對(duì)骨缺損的修復(fù)能力。

1? 材料和方法

1.1 材料：3月齡，雄性健康新西蘭大白兔12只，體重約2.5kg;1%氯己定;瑞士Bio-Gide可吸收生物膜;因正畸原因拔除的人健康前磨牙若干（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科門診部提供）;高速手機(jī);金剛砂車針;Micro-CT（SkyScan 1176，SkyScan，比利時(shí)）。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1 兔顱骨骨缺損模型的建立：將12只雄性健康新西蘭大白兔用3%戊巴比妥鈉按1.0ml/kg進(jìn)行靜脈注射，麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)，備皮，消毒。在顱底、兩耳之間向后作約5cm的切口，切開皮膚，皮下組織，肌層及骨膜，暴露顱骨，用球鉆在顱骨區(qū)制備4個(gè)直徑8mm的骨缺損（見圖1），同時(shí)用生理鹽水沖洗降溫。

1.2.2 移植材料制備：將收集到的臨床上因正畸原因拔出的人前磨牙，用高速渦輪機(jī)及金剛砂車針磨除牙釉質(zhì)及牙骨質(zhì)，去除髓腔內(nèi)牙髓。用高速渦輪機(jī)等器械將其粉碎成直徑為2～3mm大小的顆粒，經(jīng)1%氯已定溶液浸泡5min后，生理鹽水沖洗，分裝后備用。術(shù)中將取出的兔顱骨骨質(zhì)磨成2～3mm的骨塊。

1.2.3 移植材料植入手術(shù)：快速將自體骨（對(duì)照組）、人牙本質(zhì)塊（實(shí)驗(yàn)組）各約1.5g隨機(jī)放入骨缺損區(qū)，覆蓋Bio-Gide膜，創(chuàng)口分層嚴(yán)密縫合。

1.2.4 術(shù)后處理：術(shù)后3d內(nèi)每天肌肉注射40萬(wàn)U青霉素預(yù)防感染。分別于術(shù)后4、8、12周行灌注處死4只大白兔，取出實(shí)驗(yàn)樣本，置于10%中性福爾馬林固定液中固定。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 大體形態(tài)觀察：術(shù)后密切觀察兔子的飲食、活動(dòng)情況，傷口有無(wú)紅腫、溢膿。

1.3.2 放射學(xué)檢查：采用Micro-CT觀察新骨形成，將所有實(shí)驗(yàn)樣本使用Micro-CT（SkyScan 1176）掃描，數(shù)據(jù)用Nrecon軟件重建，得到各個(gè)斷層的二維圖像。將重建后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入CT analyser軟件，在每一截面選取目標(biāo)區(qū)域，在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)賦予新生骨合適的閾值，計(jì)算新生骨占骨缺損區(qū)的體積百分比，并創(chuàng)建3D模型，在CT vol中打開顯示三維效果。

1.3.3 組織學(xué)觀察：組織學(xué)標(biāo)本經(jīng)過(guò)常規(guī)固定、脫鈣、石蠟包埋，制作成5μm厚的組織學(xué)切片，進(jìn)行HE染色分析。觀察缺損區(qū)修復(fù)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 22.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用t檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 大體形態(tài)觀察：術(shù)后1d所有兔子精神、飲食較差，無(wú)畏寒、發(fā)熱征象，手術(shù)傷口無(wú)紅腫、滲血現(xiàn)象。術(shù)后2～3d兔子精神、飲食、活動(dòng)情況好轉(zhuǎn)，1周后恢復(fù)正常。所有兔子術(shù)后無(wú)感染、無(wú)動(dòng)物死亡。術(shù)區(qū)大體觀察見圖2。

2.2 放射學(xué)檢查：Micro-CT結(jié)果表明：對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，新骨生成量增加。BV/TV比值（%）及統(tǒng)計(jì)學(xué)差異見表1。見圖3。

2.3 組織學(xué)觀察：組織學(xué)切片HE染色后，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組可見新骨形成，成骨細(xì)胞、纖維結(jié)締組織及新生骨組織圍繞移植材料分布。術(shù)后4周，移植物周圍可見少量炎細(xì)胞，少量新生骨形成;術(shù)后8周，圍繞移植材料周圍，成骨細(xì)胞增多，新生骨面積增大;術(shù)后12周，移植材料周圍可見大量新生骨組織，排列逐漸變得規(guī)則。實(shí)驗(yàn)組染色結(jié)果見圖4。

3? 討論

目前，組織工程學(xué)中應(yīng)用牙本質(zhì)主要有以下四種形式[7]：①提取牙本質(zhì)中的非膠原蛋白;②使用脫礦牙本質(zhì);③去除牙本質(zhì)中的有機(jī)成分;④使用未改性牙本質(zhì)如：凍干牙本質(zhì)、液氮冷凍牙本質(zhì)。有研究表明：牙本質(zhì)脫礦增加了其在組織工程學(xué)應(yīng)用中的優(yōu)勢(shì)[8]。牙本質(zhì)脫礦有利于生長(zhǎng)因子及蛋白質(zhì)釋放從而有利于骨誘導(dǎo)性[9]。但1998年有報(bào)道顯示部分脫礦牙本質(zhì)顆粒未見骨誘導(dǎo)性[10]。在脫礦過(guò)程中最重要的是防止蛋白質(zhì)變性。有研究表明，去除牙本質(zhì)有機(jī)成分形成的變性牙本質(zhì)會(huì)降低自身的機(jī)械強(qiáng)度[11]，使其不能很好的應(yīng)用于承受應(yīng)力的骨組織區(qū)。因此，未脫礦及變性的牙本質(zhì)應(yīng)用也是非常重要的。

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)中，均有將牙本質(zhì)植入牙槽嵴缺損區(qū)，后在缺損區(qū)行種植的報(bào)道。如：Frank Schwarz教授利用自體牙根部牙本質(zhì)作為骨增量材料，在8只獵狐犬上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，12周后，埋入種植體，結(jié)果顯示牙槽嵴增量高度、種植體與骨結(jié)合率良好[12]。對(duì)1名32歲女性患者，使用拔除的牙根制成牙本質(zhì)后，行牙槽嵴骨增量手術(shù)，24周后進(jìn)行種植。結(jié)果顯示了良好的骨生成以及種植體的穩(wěn)定[13]。

本實(shí)驗(yàn)采用人牙本質(zhì)移植至兔顱骨。牙本質(zhì)周圍未見明顯炎癥反應(yīng)，說(shuō)明牙本質(zhì)的免疫原性反應(yīng)不是主要因素。牙齒的免疫原性與軟組織、牙周韌帶和牙髓有關(guān)，在本實(shí)驗(yàn)中，牙本質(zhì)被用于移植前，牙髓等軟組織均被去除。研究中沒有發(fā)現(xiàn)明顯異種移植的免疫原性反應(yīng)，這也為牙本質(zhì)的異體和異種移植成功開辟了可能[14]。牙本質(zhì)可以從因正畸原因拔除的第三磨牙或前磨牙或其他途徑中獲得。

牙本質(zhì)內(nèi)具有骨誘導(dǎo)性，在植入骨缺損中能夠融合并逐漸被骨取代，很可能是因?yàn)檠辣举|(zhì)中含有骨形成蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）[15]。目前，對(duì)BMP的臨床應(yīng)用是一個(gè)熱點(diǎn)，問(wèn)題是為BMP尋找一個(gè)載體，可使BMP緩慢釋放，且載體本身不應(yīng)引起任何炎癥反應(yīng)[16]。

綜上，本實(shí)驗(yàn)采用異種牙本質(zhì)修復(fù)兔顱骨骨缺損，經(jīng)體內(nèi)觀察，發(fā)現(xiàn)其生物相容性良好，驗(yàn)證了其具有促進(jìn)骨缺損修復(fù)的能力，有望為促進(jìn)骨缺損修復(fù)提供新的思路。對(duì)于如何處理牙本質(zhì)以增加其骨誘導(dǎo)性及骨傳導(dǎo)性，還需要更進(jìn)一步的研究。

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[收稿日期]2019-07-31

本文引用格式：葉嵐，王銀龍，陳玉成，等.異種牙本質(zhì)修復(fù)兔顱骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2020，29（2）：82-84.