陳紹斐，王 剛，劉會娟，王子雯，許孟月

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州， 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州，450000）

皮膚老化是由內(nèi)部和外部因素引起的，分為皮膚自然老化和光老化[1]。隨著環(huán)境問題和人們生活習(xí)慣的改變，皮膚老化疾病的發(fā)生率逐漸上升，皮膚光老化不僅加速皮膚衰老，同時導(dǎo)致皮膚皺紋增多，皮膚干燥粗糙，還與皮膚癌的發(fā)生有著密切關(guān)系[2-4]。近年來傳統(tǒng)中藥對皮膚光老化的研究報道增多，研究發(fā)現(xiàn)加味茵陳蒿湯與皮膚抗炎相關(guān)[5]。本研究擬通過在動物模型基礎(chǔ)上，開展加味茵陳蒿湯對皮膚光老化的防治作用，并探討其作用機(jī)制。本研究通過UVA為光源的輻射大鼠背部，復(fù)制皮膚光老化大鼠模型，并對光老化動物模型進(jìn)行中藥加味茵陳蒿湯干預(yù)，檢測各組大鼠皮膚中氧化應(yīng)激和Nrf-2通路等指標(biāo)，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組實(shí)驗(yàn)動物

SD大鼠36只，4周齡，隨機(jī)分成4組（n=9），空白組（不經(jīng)任何處理，NC）、模型組（脫毛器脫毛和紫外線照射，MC）、加味茵陳蒿湯低濃度組（脫毛器脫毛和紫外線照射及加味茵陳蒿湯15g/Kg/d干預(yù)，Experimental L）、加味茵陳蒿湯高濃度組（脫毛器脫毛和紫外線照射及加味茵陳蒿湯30g/Kg/d干預(yù)，Experimental H）。各組大鼠在普通級動物房內(nèi)飼養(yǎng)，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水。藥物組每天給予一次中藥灌胃，空白組、模型組每天給與一次相同容量生理鹽水灌胃，各實(shí)驗(yàn)組均持續(xù)灌胃至試驗(yàn)結(jié)束。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

紫外輻射儀（德國Waldmann）；電動剃毛器（中國飛利浦）；SDS-PAGE 試劑盒、ECL發(fā)光液和RIPA蛋白裂解液均購自碧云天生物技術(shù)公司；半干轉(zhuǎn)膜儀購自美國BIO-RAD公司。MDA試劑盒、CAT試劑盒、SOD試劑盒均購至北京博奧森。

1.3 光老化大鼠模型

UVA照射前將模型組、加味茵陳蒿湯低濃度組和加味茵陳蒿湯高濃度組大鼠背部右側(cè)皮膚進(jìn)行機(jī)械性脫毛，脫毛區(qū)面積約1.5×1.5cm2，以后每次照射前用電動脫毛器脫毛。將大鼠置于自制固定器后距UVA聯(lián)合UVB光源10cm處進(jìn)行照射，每天30min，其每天照射強(qiáng)度是4.5 J/cm2。持續(xù)照射10W，UVA總照射劑量達(dá)到文獻(xiàn)報道的劑量。

1.4 中藥干預(yù)

藥物組成：茵陳蒿30g、梔子15g、大黃10g，青蒿10g、黃芩12g、生地15g、菊花15g、夏枯草15g，制備：方中藥物量為60kg成人的一日量，先取茵陳蒿，加水10倍量浸泡1h，先煎40min，后加入其他藥再煎15min，濾過取汁；藥渣加水5倍量，煎煮20min，濾過取汁；合并兩次藥液，濃縮至適宜體積備用。

1.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)和MDA測定

組織勻漿的制備：取大鼠背部紫外線誘導(dǎo)部位皮膚組織制成 10%組織勻漿，以 4000rpm 的速度離心10min，取上清液進(jìn)行各指標(biāo)測定。嚴(yán)格按照CAT、SOD、MDA試劑盒說明書操作，分別分光光度計比色，測各管吸光度 A 值，代入試劑盒說明書中公式，分別計算皮膚組織中CAT、SOD、MDA的含量并對比分析。

1.6 Western blot檢測Nrf2和HO-1蛋白含量：

RIPA蛋白裂解液皮膚組織細(xì)胞進(jìn)行冰上蛋白裂解30 min，提取總蛋白，以BCA法測定樣品蛋白的濃度。以4：1的比例加入蛋白上樣緩沖液，混勻，沸水浴變性5 min，離心取上清，取60 μg目的蛋白、蛋白Marker進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳。然后用PVDF進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，2.5%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉，TBST洗滌，4℃條件下，將封閉后的PVDF膜放入1:1000倍稀釋的一抗中反應(yīng)過夜，以封閉液洗膜3次，每次5min，再在37℃下將PVDF膜轉(zhuǎn)入1:2000倍稀釋的二抗中反應(yīng)2 h。于暗室內(nèi)ECL試劑盒顯影曝光：滴加化學(xué)發(fā)光劑顯影，以凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。Quantity One 4.62圖像分析軟件進(jìn)行條帶灰度分析，Image J分析目的條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，檢測目的蛋白的表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 加味茵陳蒿湯抑制皮膚光老化大鼠氧化應(yīng)激

從表1結(jié)果分析可見，與NC組相比較，紫外線輻射誘導(dǎo)MC組皮膚組織CAT活性、SOD活性下降和MDA含量上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與MC組相比，加味茵陳蒿湯低濃度灌藥組皮膚組織CAT活性、SOD活性下降和MDA含量升高，其中高濃度藥物治療效果較優(yōu)（P＜0.05）。

2.2 加味茵陳蒿湯檢測加味茵陳蒿湯抑制皮膚光老化大鼠皮膚組織Nrf2/HO-1信號通路

結(jié)果如圖1和表2顯示，其中NC組大鼠皮膚組織中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)分泌無變化，結(jié)果無顯著性差異（P＞0.05）；與NC組相比較，紫外線輻射誘導(dǎo)MC組皮膚組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與MC組相比，加味茵陳蒿湯低濃度灌藥組皮膚組織Nrf2和HO-1蛋白增多，并且高濃度藥物較低濃度藥物組具有明顯的促進(jìn)作用（P＜0.05）

表1 加味茵陳蒿湯對皮膚光老化大鼠皮膚組織中CAT活性、SOD活性和MDA含量的影響（±s，n=9）

表1 加味茵陳蒿湯對皮膚光老化大鼠皮膚組織中CAT活性、SOD活性和MDA含量的影響（±s，n=9）

注：與NC組比較，*P＜0.05；與MC組比較，# P＜0.05

圖1 Western blot檢測大鼠皮膚組織中p-Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)（±s，n=9）

表2 加味茵陳蒿湯影響皮膚光老化大鼠皮膚組織中p-Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)（±s，n=9）

表2 加味茵陳蒿湯影響皮膚光老化大鼠皮膚組織中p-Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)（±s，n=9）

注：與NC組比較，*P＜0.05；與MC組比較，# P＜0.05

3 討論

加味茵陳蒿湯組方中茵陳蒿、梔子、大黃主治濕熱之證，具有清熱利濕的功效，為君藥，青蒿、黃芩、菊花清熱解毒，可增強(qiáng)燥濕功效，為臣藥，生地、夏枯草為使藥，可養(yǎng)陰生津、散結(jié)消腫、活血化瘀，諸藥合用，可共奏清熱利濕之功效。王韻等[6]報道采用反相高效液相色譜法測定茵陳蒿湯成分，發(fā)現(xiàn)其含有濱蒿內(nèi)酯、兒茶素、綠原酸、東莨菪內(nèi)酯等多種成分?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，茵陳蒿[7]可鎮(zhèn)痛、解熱、消炎，梔子[8]可消腫、鎮(zhèn)靜、抗炎，大黃[9]具有很強(qiáng)的抗氧化作用，能調(diào)節(jié)免疫、抗炎、止痛，青蒿[10]可降溫鎮(zhèn)痛，抑制細(xì)菌，黃芩[11]具有抗病毒、抗炎、抗氧化作用，生地具有清除自由基、抗炎作用，菊花[12]可保護(hù)肝功能、抗炎，夏枯草[13]可擴(kuò)張血管，增加皮損位置血液供給，且可抗炎、抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫。加味茵陳蒿湯配合穴位注射丹參注射液治療痤瘡，可明顯改善患者病癥，效果較好[5]。加味茵陳蒿湯對皮膚光老化的作用的報道目前較少。

皮膚光老化是屬于外源性老化，其臨床表現(xiàn)為皮膚粗糙、皺紋增多、皮膚老化彈性喪失、皮革樣外觀并常附有色素沉積；通常高暴露人群皮膚老化發(fā)生時間會提前，更易引發(fā)鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌等，嚴(yán)重威脅人類健康[4]。紫外線輻射皮膚組織誘導(dǎo)ROS大量積累，并導(dǎo)致炎癥因子過度表達(dá)，降低細(xì)胞生長因子表達(dá)和促進(jìn)MMPs的異常分泌，最終導(dǎo)致皮膚組織結(jié)構(gòu)和功能性發(fā)生改變，多個抗炎抗氧化作用的藥物對皮膚光老化具有明顯的抑制作用，如燈盞花素[14]、玉屏風(fēng)散[15]。氧化應(yīng)激與皮膚光損傷的發(fā)病息息相關(guān)[16]。CAT是一種穩(wěn)定的過氧化氫分解酶，皮膚抗氧化系統(tǒng)中重要的抗氧化酶[17]。SOD是機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)一個重要成員，可催化體內(nèi)超氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，清除氧自由基，維持機(jī)體氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡[18]。本研究檢測結(jié)果顯示紫外線輻射大鼠皮膚組織中CAT活性、SOD活性下降，與MC組相比，加味茵陳蒿湯灌藥大鼠皮膚組織CAT活性、SOD活性提升和抑制MDA含量。Nrf2是調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，正常生理狀態(tài)下與Keap1偶聯(lián)結(jié)合，親電子物質(zhì)或氧自由基可修飾Keap1的半胱氨酸，增加Nrf2的穩(wěn)定性，并轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合抗氧化反應(yīng)原件，提高抗氧化蛋白基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[19]。本研究顯示，紫外線處理大鼠皮膚組織中HO-1蛋白和Nrf2磷酸化蛋白表達(dá)下降，與MC組相比，加味茵陳蒿湯灌藥大鼠皮膚組織HO-1蛋白和Nrf2磷酸化蛋白表達(dá)含量升高。結(jié)合以上幾項(xiàng)研究結(jié)果提示加味茵陳蒿湯不僅可以通過提高抗氧化酶類活性減少氧自由基的堆積，以及與自身所具有的清除自由基的協(xié)同作用而發(fā)揮抗光老化作用，而且還可通過抑制Nrf2的活化發(fā)揮其抗皮膚光老化的干預(yù)作用。

種種現(xiàn)象表明了日光損傷以及加味茵陳蒿湯對光老化損傷的保護(hù)作用可能與HO-1/Nrf2信號通路的激活有關(guān)。Nrf2有抑制調(diào)亡和促進(jìn)凋亡基因表達(dá)的雙重作用，那么如何調(diào)控表皮細(xì)胞向著有利于皮膚組織生存的方向發(fā)展是今后研究的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)研究加味茵陳蒿湯與HO-1/Nrf2信號通路的關(guān)系為光老化保護(hù)以及再修復(fù)作用機(jī)制的研究奠定了一定的基礎(chǔ)，并可能為皮膚組織損傷再修復(fù)的治療開辟新的途徑。綜上所述，加味茵陳蒿湯可抑制光老化皮膚組織氧化應(yīng)激，增加HO-1蛋白和Nrf2磷酸化蛋白表達(dá)，為中醫(yī)藥在皮膚美容和抗老化的應(yīng)用研究提供科學(xué)依據(jù)，可進(jìn)行深入研究，闡述其作用機(jī)制。