劉嘉慶 張大偉 李光

(1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放療科，遼寧 沈陽 110001；2長春市人民醫(yī)院普通外科)

胃癌發(fā)病率居惡性腫瘤的第二位，死亡率居惡性腫瘤的第六位〔1〕。我國胃癌發(fā)病人口和死亡人口超過世界的40%〔2，3〕。胃癌的發(fā)生涉及多基因、多蛋白的改變過程，因此發(fā)現(xiàn)針對(duì)胃癌治療的靶基因有重要的臨床意義。內(nèi)皮素(ET)是由21種氨基酸殘基組成的具有血管活性的多肽，在諸多惡性腫瘤中呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)，其中以ET-1表達(dá)更為突顯。P53基因是人體抑癌基因，其失活對(duì)腫瘤形成起重要作用，本研究探討胃癌組織中ET-1、P53基因的表達(dá)與胃癌病理因素的關(guān)系及ET-1與P53基因的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2019年1～10月住院治療的50例胃癌患者為胃癌組，其中女25例，男25例。年齡45～75〔平均(60±5.8)〕歲。術(shù)后明確病理診斷為胃癌，胃癌分期以2010國際抗癌聯(lián)盟公布的病理、腫瘤、淋巴結(jié)(PTNM)分期為標(biāo)準(zhǔn)。其中乳頭狀腺癌10例，管狀腺癌15例，低分化腺癌15例，黏液腺癌5例，印戒細(xì)胞癌5例。同時(shí)將距離腫塊邊緣5 cm外的對(duì)應(yīng)癌旁正常組織50例作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前均行胃鏡檢查，明確病理診斷為胃癌；(2)未接受過放、化療或靶向治療；(3)預(yù)期生存期>3個(gè)月；(4)心、肝、腎等主要臟器功能基本正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)接受過放、化療或靶向治療；(2)骨轉(zhuǎn)移患者、存在嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松；(3)存在嚴(yán)重或不能控制的全身性疾病的證據(jù)；(4)無法控制的活動(dòng)性感染；(5)各類傳染病?；颊咭话阗Y料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，均知情同意，并經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 ET-1-P53兔抗人多克隆抗體，免疫組化試劑盒購自長春可研生物有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 標(biāo)本均采用10%甲醛溶液固定。常規(guī)石蠟包埋、切片、染色。取石蠟組織常規(guī)連續(xù)切片，厚約4 μm。步驟分別如下：

胃癌組織ET-1檢測(cè)：采用免疫組化法(IHC)測(cè)定，所檢測(cè)標(biāo)本用ABC法標(biāo)記。具體步驟如下：①制作石蠟切片；②脫蠟；③去除內(nèi)源酶 3%H2O215 min；④蒸餾水與0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.4)浸洗；⑤一抗：兔抗大鼠ET-1抗血清(上海德波生物技術(shù)有限公司)1∶400，4℃過夜孵育；⑥PBS 浸洗；⑦二抗：生物素化羊抗兔抗血清1∶500，37℃ 30 min；⑧PBS浸洗；⑨三抗：ABC復(fù)合物，1∶100，37℃40 min；⑩二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，5 min。每例切片選5個(gè)高倍視野(×400)，隨即選測(cè)80～100個(gè)ET-1細(xì)胞的吸光度值，計(jì)算平均吸光度值，以平均值(A)表示細(xì)胞中的ET-1的含量。

利用常規(guī)的ABC法對(duì)P53蛋白進(jìn)行檢測(cè)，微波修復(fù)抗原。采用免疫組化En Vision二步法，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明書操作。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽性組織作陽性對(duì)照。按照染色的強(qiáng)度計(jì)分，0分為無色，1分為淺色、2分為棕色、3分為褐色。陽性細(xì)胞百分比按照總分3分來測(cè)定，≤0.05是0分，0.06～0.25為1分，0.26～0.50為2分，≥0.51為3分。

1.4結(jié)果判定 ET-1表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞膜呈少量的陽性表達(dá)，出現(xiàn)淡黃色或棕色顆粒者為陽性表達(dá)，若陽性細(xì)胞在標(biāo)記的細(xì)胞總數(shù)中超過60%以上者，標(biāo)記為陽性病例。P53蛋白表達(dá)位于細(xì)胞核，呈現(xiàn)淡黃色或棕色顆粒分布為陽性細(xì)胞。在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察大于5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)≥1 000個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性，≥10%為陽性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組ET-1和P53蛋白的表達(dá) 胃癌組ET-1和P53蛋白表達(dá)陽性率〔38例(76.0%)，41例(82.0%)〕均顯著高于對(duì)照組〔11例(22.0%)，10例(20.0%)；P<0.05〕。

2.2胃癌組織中ET-1和P53的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系 有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同臨床分期患者ET-1和P53蛋白陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。組織學(xué)分級(jí)患者ET-1和P53蛋白陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 胃癌組織中ET-1和P53表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系〔n(%)〕

2.3ET-1和P53蛋白表達(dá)的相關(guān)性 ET-1和P53蛋白共同陽性32例，共同陰性3例，二者呈正相關(guān)(r=0.511,P=0.000)。

3 討 論

ET是1988年由Yanagisawa等〔4〕首次從培養(yǎng)的豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞上清液中分離并純化出來的，由21種氨基酸殘基組成的血管活性多肽。ET由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生釋放，以極低的生理濃度釋放，其中以ET-1生理作用最強(qiáng)，在惡性腫瘤患者血清中ET-1濃度最高，其主要作用于周圍淋巴結(jié)，在腫瘤侵襲中表現(xiàn)出器官特異性〔5〕。在乳腺癌患者的血清中ET-1水平明顯增高，且與腫瘤惡性程度呈正比〔6〕，浸潤性癌中ET-1過度表達(dá)并激活水平基因轉(zhuǎn)移(HGT)，從而促使其發(fā)生骨轉(zhuǎn)移〔7〕。ET不但能促使癌細(xì)胞淋巴管生成〔8〕，還能促進(jìn)惡性腫瘤新生血管形成〔9〕，為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移提供重要理論基礎(chǔ)。

P53蛋白基因包括野生型和突變型，野生型P53蛋白基因位于染色體17p13.1〔10〕，屬于細(xì)胞調(diào)控基因。當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，野生基因可有效誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡〔11〕，使得細(xì)胞在新的周期內(nèi)得到修復(fù)和恢復(fù)，進(jìn)而有效抑制腫瘤發(fā)生〔12〕。野生型P53蛋白半衰期較短，IHC在有效檢測(cè)過程中不易檢測(cè)到，在腫瘤組織的檢測(cè)中，一般檢測(cè)出的P53蛋白是經(jīng)過突變后得到的P53蛋白〔13〕。

本研究結(jié)果表明ET-1和P53蛋白表達(dá)升高在胃癌發(fā)生過程中有一定的作用。有研究表明，ET-1能夠使得P53蛋白基因發(fā)生突變，P53蛋白基因通過加強(qiáng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化加快惡化，在腫瘤治療時(shí)起到有效抵制的作用。ET-1和P53蛋白異常表達(dá)共同參與了胃癌的發(fā)生及發(fā)展過程。本文結(jié)果與國內(nèi)研究相一致〔14〕，說明ET-1是由癌組織本身分泌或釋放的一種物質(zhì)，其在血清中也呈高表達(dá)〔14〕。

綜上，ET-1和P53蛋白表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移之間存在一定的聯(lián)系，能夠在胃癌的早期檢測(cè)和預(yù)后評(píng)估及靶向治療中提供依據(jù)〔15〕。ET-1和P53蛋白在胃癌發(fā)生、發(fā)展的過程中相互調(diào)節(jié)的有效機(jī)制需進(jìn)一步研究。