張冰雪，楊敏光，李建鴻，陶靜,,3，梁勝祥，柳維林，陳立典,,3

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建福州市 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)療技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建福州市 350122；3.福建省康復(fù)技術(shù)協(xié)同中心，福建福州市 350122

血管性癡呆(vascular dementia,VD)又稱血管性認(rèn)知功能障礙，是指由腦血管病變引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙等一系列癥狀。我國65 歲以上人群中，1.1%～3.0%被診斷為癡呆，其中VD 占0.9%[1-2]。VD已成為僅次于阿爾茨海默病的第二大老年性癡呆疾病[3]，給家庭和社會帶來巨大的影響和負(fù)擔(dān)。

腦血管病變包括腦白質(zhì)損傷、腔隙性梗死和微出血，其中腦白質(zhì)損傷是造成VD 的重要原因[4]。磁共振彌散張量成像(diffusion tensor imaging,DTI)是在體研究白質(zhì)的有效工具，主要通過彌散各向異性分?jǐn)?shù)(fractional anisotrophy,FA)等指標(biāo)，量化觀察白質(zhì)纖維束的完整性[5]，實(shí)現(xiàn)可視化研究VD 腦白質(zhì)損傷[6]。VD患者認(rèn)知功能障礙與腦白質(zhì)改變相關(guān)[7]，腦白質(zhì)彌漫性病變甚至早于臨床癥狀出現(xiàn)[8-9]。

針刺在VD治療中應(yīng)用廣泛。電針可有效增強(qiáng)VD患者的學(xué)習(xí)和記憶能力[10-11]；針刺可明顯改善VD模型大鼠總體認(rèn)知功能[12-13]。皮質(zhì)下VD患者腦缺血側(cè)白質(zhì)纖維FA 降低[14]；VD 患者全腦平均FA 較正常人低[15]。電針干預(yù)后，模型大鼠腦缺血灶中心和邊緣FA 增加[16]。本課題組前期研究證實(shí)，電針百會、神庭能影響癡呆大鼠腦結(jié)構(gòu)，治療認(rèn)知功能障礙[17-19]。本研究利用DTI 觀察電針百會、神庭前后白質(zhì)纖維情況，以探討電針治療VD可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性Sprague-Dawley 大鼠，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物公司，生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2014-0002，體質(zhì)量(280±30) g。于福建中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級實(shí)驗(yàn)動物中心分籠喂養(yǎng)，許可證號SYXK(閩)2014-001。全部動物實(shí)驗(yàn)倫理均通過動物管理委員會審批，并嚴(yán)格遵從國際動物保護(hù)法規(guī)施行。

1.2 儀器和試劑

戊巴比妥鈉(CQ6125000)：SIGMA 公司。動物用青霉素鈉：山東魯抗。異氟烷(R510-22)：RWD 公司。小動物磁共振成像儀(MiniMR-60 MRI system 7.0 T)：德國BRUKER 公司。SDZ-V 型電針儀、華佗牌毫針(直徑0.25 mm、長13 mm)：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司。

1.3 模型與分組

將大鼠分為造模組和假手術(shù)組(n=8)。造模組參照Huang 等[20]的方法造模。大鼠術(shù)前禁食24 h，隨后稱重。大鼠用2%戊巴比妥鈉2 ml/kg 腹腔注射麻醉，仰臥置于專用手術(shù)保溫墊上，四肢用醫(yī)用膠帶粘附固定，不可粘貼過緊，以免出現(xiàn)四肢末端缺血損傷。75%酒精于鎖骨上緣至頜下約5×3.5 cm 區(qū)域消毒，剔毛備皮。鑷子夾起頸部皮膚，沿正中線切開，從左側(cè)胸骨舌骨肌、胸鎖乳突肌和肩胛舌骨肌交叉點(diǎn)向下分離，找到左頸總動脈，顯微鑷小心分離頸總動脈與迷走神經(jīng)，在頸總動脈與迷走神經(jīng)間穿一條不可吸收的外科縫合線，結(jié)扎左頸動脈。5 min 后同法分離并結(jié)扎右頸總動脈。假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動脈，不進(jìn)行結(jié)扎。清潔創(chuàng)口，縫合皮膚。腹腔注射動物用青霉素鈉溶液0.5 ml/kg。大鼠置于盛有木屑的托盤內(nèi)，26 ℃左右室溫，自然蘇醒，回籠飼養(yǎng)。

術(shù)后12 d 對大鼠行新物體識別試驗(yàn)[23]。與假手術(shù)組相比，造模組中新物體偏愛系數(shù)降低的大鼠視為造模成功。納入模型大鼠24只，隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組(n=8)、非穴組(n=8)和電針組(n=8)。

1.4 干預(yù)方法

術(shù)后14 d，電針組參照方劍喬等[21]的定位方法取百會、神庭行電針干預(yù)，疏密波，頻率1/20 Hz，刺激強(qiáng)度1 mA。每天固定時間干預(yù)1次，持續(xù)30 min。

非穴組取雙側(cè)腋下非經(jīng)非穴點(diǎn)[22]，同法電針干預(yù)。

模型組和假手術(shù)組同等條件抓取。

1.5 新物體識別試驗(yàn)

造模后12 d (干預(yù)前)和40 d (干預(yù)前)，于上午9:00～12:00 對大鼠進(jìn)行測試。在特殊材料制成的80×80×60 cm 無頂敞箱內(nèi)，放置不易被大鼠推倒的罐子作為識別物體，分為A、B 兩組。A 組為兩個完全相同物體(A、a)，B 組是一個與A 物體大小相似的物體(B)，且大鼠在生活環(huán)境中從未見過。敞箱上方固定光源和攝像機(jī)，使用Super Maze動物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)追蹤大鼠的活動軌跡，記錄其在敞箱內(nèi)活動和與物體接觸的情況。實(shí)驗(yàn)過程中保持敞箱和光源的位置不變，實(shí)驗(yàn)過程中保持安靜。實(shí)驗(yàn)為適應(yīng)、學(xué)習(xí)、測試3個階段，持續(xù)3 d。

適應(yīng)階段：將實(shí)驗(yàn)大鼠放于沒有任何物體的敞箱中自由探索10 min。學(xué)習(xí)階段：適應(yīng)24 h 后，在箱內(nèi)同側(cè)兩個角落分別放置物體A 和a，將大鼠背朝物體放入敞箱，自由探索10 min。測試階段：學(xué)習(xí)后1 h和24 h，將大鼠熟悉的物體a 換成新物體B，大鼠背對物體放入敞箱，自由探索5 min。

每只大鼠測試前，將敞箱和物體用75%酒精擦拭，以祛除上一只大鼠的氣味殘留。

判別標(biāo)準(zhǔn)：大鼠用鼻子、胡須、前肢觸碰探索物體，或鼻子、胡須與識別物體間的間隔≤2 cm 記為識別行為；趴在物體上向四周探索或在物體旁轉(zhuǎn)身、下蹲均記為識別行為。大鼠在測試階段探索物體A、B的時間記為T1、T2，偏愛系數(shù)β=T2/(T1+T2)×100%。學(xué)習(xí)后1 h和24 h的偏愛系數(shù)記為β1和β2。

1.6 DTI

干預(yù)前后，大鼠行DTI 掃描。大鼠3%異氟烷誘導(dǎo)麻醉5 min，100 μg/ml 鹽酸美托嘧啶0.5 ml/kg 下肢肌肉注射深度麻醉，俯臥位置于磁共振掃描床上，頭部戴專用表面線圈，牙桿和雙側(cè)耳桿固定。水循環(huán)加熱系統(tǒng)維持大鼠體溫相對恒定，SurgiVet V3395TPR生理檢測儀(美國SMITHS MEDICAL 公司)實(shí)時監(jiān)測大鼠體溫、呼吸和心率。掃描參數(shù)：TE 32.25 ms，TR 12000 ms，F(xiàn)OV 32×32 mm，Segment 4，Averages 1，Image Size 128×128，Slices 48，b01000 s/mm2，Slice Thickness 0.56 mm，no slice gap。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)用()表示，經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布且方差齊，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。顯著性水平α=0.05。

采用FSL(http://fmrib.ox.ac.uk/fsl)和spmratIHEP[24]軟件分析DTI 數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)行渦流矯正；手動顱骨剝離得到全腦掩膜圖像，計(jì)算各動物b0像和全腦FA 像；將b0像配準(zhǔn)到大鼠標(biāo)準(zhǔn)腦模板，保留變換函數(shù)，實(shí)現(xiàn)FA 像向大鼠標(biāo)準(zhǔn)腦膜版的空間標(biāo)準(zhǔn)化[25]；采用3 倍體素平滑核平滑；基于一般線性模型，采用方差分析，對平滑后數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.005、團(tuán)簇＞10為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 新物體識別試驗(yàn)

干預(yù)前，與假手術(shù)組相比，模型組、電針組和非穴組β1和β2均下降(P＜0.05)，后三組間無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

干預(yù)后，與模型組相比，電針組β1和β2均升高(P＜0.05)。見表2。

表1 干預(yù)前各組新物體偏愛系數(shù)的比較(%)

表2 干預(yù)后各組新物體偏愛系數(shù)比較(%)

2.2 DTI

干預(yù)前，與假手術(shù)組相比，模型組胼胝體、扣帶回、海馬、外囊白質(zhì)纖維FA 降低(圖1)。干預(yù)后，與模型組相比，非穴組海馬白質(zhì)纖維FA增加(圖2)，電針組海馬、扣帶回、胼胝體、外囊白質(zhì)纖維FA增加(圖3)；與非穴組相比，電針組海馬、胼胝體、外囊白質(zhì)纖維FA 增加(圖4)。

3 討論

VD 屬中醫(yī)“呆病”，基本病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，病位在腦但涉及臟腑。多因氣血虧虛，加之內(nèi)傷勞倦，引起陰陽失調(diào)；髓海不足，陽氣衰虛；痰濁瘀阻，神機(jī)失用，遂為癡呆[26-27]。督脈陽氣虛衰所致臟腑功能低下是癡呆病主要原因之一[28]。百會、神庭為督脈要穴，百脈之會，神志所在，是上行之氣聚集處。針刺百會、神庭可通行氣血、升陽舉陷、開竅醒腦，治療癡呆等神志病變。

針刺療法能有效治療VD 所致的認(rèn)知功能障礙[29-30]。馬莉等[31]綜述近10 年針刺治療VD 的相關(guān)報(bào)道，顯示針刺法療效優(yōu)于一般藥物組或常規(guī)治療組。邵瑛等[32]電針百會等穴，明顯改善VD 模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。江一靜等[33]針刺百會、神庭，提高非癡呆型血管性認(rèn)知障礙患者的認(rèn)知能力。本研究顯示，電針百會、神庭能增加認(rèn)知相關(guān)腦區(qū)白質(zhì)纖維FA，有效改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

圖1 模型組與假手術(shù)組FA差異圖

圖2 非穴組與模型組FA差異圖

圖3 電針組與模型組FA差異圖

圖4 電針組與非穴組FA差異圖

新物體識別試驗(yàn)可檢測大鼠的總體認(rèn)知功能。先讓動物熟知兩個物體，隨后將其中一個換成新物體，動物本能將探尋新物體，較少探尋熟知物體。通過比較對新物體的探尋時間占整個探尋時間的比例判斷大鼠的記憶能力。若大鼠對新舊物體的探尋指數(shù)無差異，表明大鼠存在記憶障礙。VD 模型小鼠新物體識別試驗(yàn)顯示顯著的學(xué)習(xí)和記憶障礙，治療后新物體辨別指數(shù)和辨別系數(shù)提高[34]。本研究顯示，電針百會、神庭能提高VD大鼠的記憶能力。

白質(zhì)主要由有髓纖維和膠質(zhì)細(xì)胞組成，連接各皮質(zhì)，負(fù)責(zé)神經(jīng)元間信號傳遞，對學(xué)習(xí)、記憶有重要影響[35]，腦白質(zhì)損傷可引起不同程度認(rèn)知功能下降[35]。VD 患者的認(rèn)知功能障礙與腦白質(zhì)損傷相關(guān)[36]。特定位置白質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性與特定認(rèn)知障礙有關(guān)，癡呆患者前額葉、海馬等腦區(qū)白質(zhì)纖維受損，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[37]。

FA 能量化評價(jià)腦白質(zhì)纖維損傷。VD 患者腦缺血側(cè)白質(zhì)纖維FA 降低，主要集中于雙側(cè)前額葉、扣帶回、海馬和下額枕束區(qū)[8,14]。電針后白質(zhì)纖維見不同程度重構(gòu)[38]。本研究顯示，VD 模型大鼠電針干預(yù)后，白質(zhì)纖維改變主要存在于胼胝體、扣帶回、外囊等腦區(qū)，集中在前額葉皮質(zhì)、海馬等重要部位，提示電針能夠修復(fù)認(rèn)知功能相關(guān)腦區(qū)白質(zhì)纖維損傷。

綜上所述，電針百會、神庭可修復(fù)VD 大鼠白質(zhì)纖維束損傷，特別是與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的前額葉、海馬等腦區(qū)，白質(zhì)的恢復(fù)與認(rèn)知功能恢復(fù)相關(guān)。電針非穴和特定穴位對不同腦區(qū)白質(zhì)纖維及認(rèn)知障礙的影響仍需進(jìn)一步研究。