高玉榮 李大鵬 張鳳琴

摘要：為了提高植物乳桿菌的活細(xì)胞數(shù)，以普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過單因素試驗和正交試驗對植物乳桿菌的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，葡萄糖、酵母浸粉、硫酸鎂和番茄汁對植物乳桿菌G1-28的生長有顯著性的影響。通過正交試驗確定植物乳桿菌G1-28最佳的培養(yǎng)基為葡萄糖添加量1.5%，酵母浸粉添加量2.5%，硫酸鎂添加量0.3‰，番茄汁添加量5%，在此條件下活細(xì)胞數(shù)達(dá)19.8×109 CFU/mL。

關(guān)鍵詞：植物乳桿菌;培養(yǎng)基;活細(xì)胞數(shù);正交試驗

中圖分類號：Q93 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ?doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.01.005

Abstract：In order to increase the viable number of Lactobacillus plantarum，the nutrients required for the growth of Lactobacillus plantarum were optimized by single factor experiment and orthogonal experiment based on the medium of common nutritional broth. The results showed that the concentrations of glucose，yeast extract，magnesium sulfate and ?tomato juice as growth factor had significant effects on the growth of Lactobacillus plantarum G1-28. ?The optimal medium of was glucose 1.5%，yeast extract 2.5%，magnesium sulfate 0.3‰ and tomato juice 5%. At these conditions，the viable number of Lactobacillus plantarum G1-28 was 19.8×109 CFU/mL.

Key words：Lactobacillus plantarum;culture medium;viable cell number;orthogonal experiment

0 ? 引言

隨著人們生活水平的提高，開發(fā)富含益生菌等具有改善人體健康功能的食品已經(jīng)成為食品行業(yè)的重要發(fā)展方向之一[1]。研究表明，植物乳桿菌是一種重要的益生菌，能分泌抗生物素類物質(zhì)，對腸道致病菌產(chǎn)生的拮抗作用，從而對人體產(chǎn)生益生作用[2]。除此之外，某些益生菌還具有同化膽固醇、提高免疫力、抗氧化等特殊保健功能[3]。

為了更好地發(fā)揮益生菌的保健功能，必須獲得大量的益生菌活細(xì)胞。高密度培養(yǎng)技術(shù)是目前獲得高活菌數(shù)的有效方法。高密度培養(yǎng)技術(shù)是指微生物菌體在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后其細(xì)胞密度達(dá)到常規(guī)培養(yǎng)的10倍以上的生長狀態(tài)[4]。一些學(xué)者對提高益生菌活細(xì)胞數(shù)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，取得了一定的研究進(jìn)展[5-6]。

前期試驗從發(fā)酵食品中分離篩選到一株具有體外降膽固醇、降甘油三酯功能的益生菌植物乳桿菌G1-28。為了更好地發(fā)揮植物乳桿菌G1-28的益生作用、獲得大量的活細(xì)胞，試驗以營養(yǎng)肉湯為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對植物乳桿菌G1-28的培養(yǎng)基進(jìn)行了研究和優(yōu)化。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 材料

1.1.1 ? 菌種

植物乳桿菌G1-28，從發(fā)酵食品中分離的具有體外降膽固醇和甘油三酯功能的益生菌，于巢湖學(xué)院食品工程實驗室保藏。

1.1.2 ? 試劑

MRS培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供;氫氧化鈉、葡萄糖、果糖、乳糖、淀粉、蛋白胨、酵母浸粉、硫酸銨、硝酸鈉、牛肉膏、硫酸鎂、氯化鈉、鹽酸，均為分析純。

1.1.3 儀器設(shè)備

TU-1810型紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司產(chǎn)品;LDZM-80KCs-III型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品;PHB-401型PH計，上海天達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品;SHP-160型智能生化培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;TG16Ws型臺式高速離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品;SW- CJ-2F型潔凈工作臺，蘇州市智拓凈化設(shè)備科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 ? 試驗方法

1.2.1 ? 菌種活化及培養(yǎng)

將-20 ℃甘油管保藏的菌種，按照1%的接種量接入10 mL已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃下靜置培養(yǎng)12～14 h進(jìn)行活化。然后，按照1%的接種量接入裝有50 mL 已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃下靜置培養(yǎng)12～14 h備用。

1.2.2 ? 植物乳桿菌培養(yǎng)基的單因素試驗

（1）碳源的選擇及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定。以營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以1%的葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、淀粉代替其中的碳源，培養(yǎng)后測定其對植物乳桿菌G1-28生長的影響。培養(yǎng)條件為初始pH值6.0，接種量2%，于30 ℃下靜置培養(yǎng)16 h（下同）。以氮源1%，NaCl 0.5%為基礎(chǔ)，研究0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%碳源對植物乳桿菌G1-28生長的影響。

（2）氮源的選擇及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定。以營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以1%的蛋白胨、酵母浸粉、硫酸銨、硝酸銨、牛肉膏替代其中的氮源，培養(yǎng)后測定其對植物乳桿菌G1-28生長的影響。在確定的最佳氮源的基礎(chǔ)上，研究0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%的氮源對植物乳桿菌G1-28生長的影響。

（3）硫酸鎂對植物乳桿菌生長的影響。在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中分別添加0，0.2‰，0.4‰，0.6‰，0.8‰，1.0‰硫酸鎂，培養(yǎng)后測定其對植物乳桿菌G1-28生長的影響。

（4）番茄汁對植物乳桿菌生長的影響。將新鮮成熟番茄清洗干凈后去蒂去皮，切塊放入榨汁機(jī)中壓榨，得到新鮮的番茄汁。添加0，5%，10%，15%， 20%新鮮番茄汁，培養(yǎng)后測定其對植物乳桿菌G1-28生長的影響。

1.2.3 ? 植物乳桿菌培養(yǎng)基研究的正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗。

1.2.4 ? 植物乳桿菌生長量的測定

采用平板計數(shù)法測定植物乳桿菌活菌數(shù)[7]。將菌懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋，從中選擇3個合適的菌懸液各0.1 mL，涂布在制備好的MRS固態(tài)培養(yǎng)基平板表面，于37 ℃下倒置培養(yǎng)24 h，計數(shù)平板表面生長的菌落數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)，即為植物乳桿菌G1-28活細(xì)胞數(shù)。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ? 植物乳桿菌培養(yǎng)基的單因素試驗

2.1.1 ? 碳源對植物乳桿菌生長的影響

（1）碳源種類對植物乳桿菌生長的影響。

碳源種類對植物乳桿菌生長的影響見圖1。

由圖1可知，植物乳桿菌G1-28在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中最高，乳糖和果糖相對較低，蔗糖和淀粉最低，表明葡萄糖作為植物乳桿菌G1-28的碳源，能更好地被利用并促進(jìn)其生長繁殖。

（2）葡萄糖添加量對植物乳桿菌生長的影響。

葡萄糖添加量對植物乳桿菌生長的影響見圖2。

由圖2可知，植物乳桿菌G1-28在葡萄糖添加量為1.5%的培養(yǎng)基中活菌數(shù)最高，隨著葡萄糖添加量的增加，活菌數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢，可能是由于葡萄糖添加量過高會導(dǎo)致菌體呼吸加快，使一些代謝產(chǎn)物不能完全氧化而積累在培養(yǎng)基中，導(dǎo)致培養(yǎng)基中的pH值過低，影響某些酶的活性，不利于植物乳桿菌G1-28的生長。因此，選擇1.5%的葡萄糖作為植物乳桿菌G1-28生長的適宜添加量。

2.1.2 ? 氮源對植物乳桿菌生長的影響

（1）氮源種類對植物乳桿菌生長的影響。

氮源種類對植物乳桿菌生長的影響見圖3。

氮源是用于構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的氮素來源，通?？梢苑譃橛袡C(jī)氮源和無機(jī)氮源。由圖3可知，植物乳桿菌在添加酵母浸粉、蛋白胨和牛肉膏等有機(jī)氮源的培養(yǎng)基中的活菌數(shù)顯著高于添加硫酸銨和硝酸銨等無機(jī)氮源的培養(yǎng)基。在有機(jī)氮源中酵母浸粉最利于植物乳桿菌G1-28的生長。因此，確定酵母浸粉為植物乳桿菌G1-28生長所需的最佳氮源。

（2）酵母浸粉添加量對植物乳桿菌生長的影響。

酵母浸粉添加量對植物乳桿菌生長的影響見圖4。

由圖4可知，酵母浸粉添加量在0.5%～2.0%時，植物乳桿菌活菌數(shù)呈上升趨勢，但當(dāng)酵母浸粉添加量大于2.0%時則呈下降的趨勢，因此選擇酵母浸粉添加量為2.0%。

2.1.3 ? 硫酸鎂對植物乳桿菌生長的影響

硫酸鎂添加量對植物乳桿菌生長的影響見圖5。

由圖5可知，硫酸鎂對植物乳桿菌G1-28生長的影響顯著，在硫酸鎂添加量為0.3‰的培養(yǎng)基中，活細(xì)胞數(shù)最大，但當(dāng)硫酸鎂添加量過大（大于0.3‰）時，不利于植物乳桿菌G1-28的生長。因此選擇硫酸鎂添加量為0.3‰。

2.1.4 ? 番茄汁添加量對植物乳桿菌生長的影響

番茄汁添加量對植物乳桿菌生長的影響見圖6。

番茄汁含有豐富的維生素、微量元素等營養(yǎng)成分可以為乳酸菌提供糖類、礦物質(zhì)和B族維生素等多種營養(yǎng)成分。由圖6可知，番茄汁添加量對植物乳桿菌G1-28的生長有促進(jìn)作用。在番茄汁添加量為0～10%的培養(yǎng)基中，植物乳桿菌G1-28活菌數(shù)呈增加的趨勢;當(dāng)番茄汁添加量大于10%時，呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，可能是由于番茄汁添加量過高，導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH值過低，不利于植物乳桿菌G1-28的生長，因此選擇番茄汁的適宜添加量為10%。

2.2 ? 植物乳桿菌培養(yǎng)基的正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，采用了L9（34）正交試驗。

正交試驗設(shè)計見表1，正交驗結(jié)果見表2。

由表4可以看出，各因素對植物乳桿菌G1-28生長的影響次序依次是酵母浸粉添加量>葡萄糖添加量>番茄汁添加量>硫酸鎂添加量。最佳培養(yǎng)基配方為A2B3C2D1，此配方不在正交試驗的9組配方中，因此需要進(jìn)行驗證試驗。

根據(jù)正交試驗所獲得的最優(yōu)組合培養(yǎng)基成分，即葡萄糖添加量1.5%，酵母浸粉添加量2.5%，硫酸鎂添加量0.3‰，番茄汁添加量5%;在初始pH值6.0，接種量2%，于30 ℃下靜置培養(yǎng)16 h，進(jìn)行3次平行試驗，測得植物乳桿菌G1-28活細(xì)胞數(shù)19.8×109 CFU/mL，驗證試驗的活細(xì)胞數(shù)大于正交試驗中的任一組合的結(jié)果，因此確定A2B3C2D1是最優(yōu)組合。

3 ? 結(jié)論

以營養(yǎng)肉湯為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過單因素試驗研究表明，葡萄糖添加量、酵母浸粉添加量、硫酸鎂添加量、番茄汁添加量對植物乳桿菌G1-28生長影響顯著。

通過正交試驗確定植物乳桿菌G1-28最佳培養(yǎng)基配方為葡萄糖添加量1.5%，酵母浸粉添加量2.5%，硫酸鎂添加量0.3‰，番茄汁添加量5%，在此條件植物乳桿菌G1-28下活細(xì)胞數(shù)達(dá)19.8×109 CFU/mL。

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