沈婷婷，李素云，李亞，卞晴晴

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州；2.呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州）

0 引言

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種與呼吸道炎癥反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)的肺部疾病，其特征性表現(xiàn)為肺泡，氣道以及微血管的進(jìn)行性炎癥反應(yīng)[1]，除累及肺臟外（影響氣道重塑以及肺氣腫的發(fā)生發(fā)展）[2]，可引發(fā)腦血管疾病，骨骼肌功能障礙，心臟病等全身肺外效應(yīng)[3]。世界衛(wèi)生組織將其與心腦血管疾病、糖尿病、惡性腫瘤以及代謝性疾病合稱為全球“四大慢病”[4]。

骨骼肌萎縮作為COPD 主要的肺外并發(fā)癥之一，常出現(xiàn)在疾病的早期階段，是患者活動(dòng)受限的主要原因，也是加快其病情惡化的關(guān)鍵因素，與COPD 患者致殘率和死亡率密切相關(guān)，影響生活質(zhì)量與預(yù)后[5]。骨骼肌結(jié)構(gòu)與代謝的改變是COPD 患者骼肌功萎縮的主要原因[6]。研究表明，COPD 骨骼肌萎縮患者的肌纖維類型可從氧化型慢肌纖維（I 型）轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒饪旒±w維（Ⅱ型）[7]，同時(shí)伴有肌纖維橫截面積的減低[8]。骨骼肌代謝方面，炎癥與機(jī)體健康狀態(tài)密切相關(guān)，COPD 患者體內(nèi)多種炎癥因子含量的增高可影響多個(gè)細(xì)胞通路，使蛋白降解速率加快，導(dǎo)致患者骨骼肌萎縮的發(fā)生[9-10]。

據(jù)研究表明瘦素（leptin,LEP）與促炎癥因子如白細(xì)胞介素-1（IL-1）和腫瘤壞死因子a（TNF-a）相關(guān)[11]。COPD 急性加重期瘦素水平會(huì)顯著增加，導(dǎo)致疾病過(guò)程中患者攝入量減少，代謝加快，出現(xiàn)消瘦、肌無(wú)力的癥狀。補(bǔ)肺健脾方可以顯著改善COPD大鼠骨骼肌萎縮，降低LEP 水平有關(guān)，其機(jī)制可能與下調(diào)核因子（nuclear factor，NF）-? B 活性有關(guān)[5]。

本研究以香煙煙霧暴露聯(lián)合細(xì)菌感染制備的COPD 大鼠模型為研究對(duì)象，觀察調(diào)補(bǔ)肺腎三方對(duì)COPD 大鼠骨骼肌萎縮的療效評(píng)價(jià)。

1 材料

1.1動(dòng)物和細(xì)菌

SPF 級(jí)SD 大鼠60 只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(豫)2017-0001。肺炎克雷伯桿菌，購(gòu)自中國(guó)生物品檢驗(yàn)鑒定所（貨號(hào)：46114），細(xì)菌濃度根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需調(diào)整為6×108CFU/mL。

1.2藥物氨茶堿片（0.1g/片)，購(gòu)自河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。補(bǔ)肺健脾方（黨參15g，黃芪15g，白術(shù)12g，陳皮9g，茯苓12g 等，每毫升含生藥量2.6496g），補(bǔ)肺益腎方（人參9g，黃芪15g，枸杞子12g，浙貝母9g，山茱萸128 等，每毫升含生藥量1.8480g），益氣滋腎方（人參9g，黃芪15g，熟地黃15g，構(gòu)杞子12g，麥冬l5g 等，每毫升含生藥量2.0160g）,由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥制劑實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3試劑與儀器

紅旗渠牌過(guò)濾嘴香煙（焦油量：14mg，煙氣煙堿量：1.2mg；煙氣一氧化碳量：15mg），購(gòu)自河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司。水合氯醛由鄭州派尼化學(xué)試劑公司提供。病理儀器：PM-10AD 光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympus，日本）；Image- ProRPus6.0 專業(yè)圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics，Inc，美國(guó)）。

2 方法

2.1模型制備

大鼠購(gòu)回后適應(yīng)環(huán)境7d，實(shí)驗(yàn)室室溫為（25±1）℃，相對(duì)濕度（50±10）%，換氣量10-15 次/h，氨濃度≤14mg/m3，噪聲≤60db，定期檢查凈化操作系統(tǒng)，保持環(huán)境安靜。滅菌飼料喂養(yǎng)，自由飲用滅菌水，采用香煙煙霧暴露聯(lián)合肺炎克雷伯桿菌反復(fù)感染的方法建立COPD穩(wěn)定期大鼠模型；經(jīng)鼻腔滴入肺炎克雷伯桿菌液0.1mL，每5天1次，持續(xù)8周。給予大鼠香煙煙霧暴露，煙霧通過(guò)導(dǎo)管進(jìn)入300L的煙霧吸入箱內(nèi)，2次/d，30min/次，2次吸煙間隔至少3h，持續(xù)12周。

每周測(cè)體重，每月測(cè)定肺功能，并根據(jù)癥狀表現(xiàn)、肺組織病理變化、肺功能數(shù)據(jù)整理分析等確定模型成功與否。

2.2分組與處理

60只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成對(duì)照組、模型組、氨茶堿組、補(bǔ)肺健脾方組、補(bǔ)肺益腎方組以及益氣滋腎方組，共6組，每組10只。

自造模后第13周的第1天，對(duì)照組和模型組用同等劑量（2mL）的0.9%氯化鈉溶液灌胃；氨茶堿組與中藥3方組分別給予氨茶堿（2.3mg/kg），補(bǔ)肺健脾方4.84g/kg（0.5g/m L），補(bǔ)肺益腎方4.44g/kg（0.5g/m L），益氣滋腎方4.84gkg（0.5g/m L）灌胃，2次/d，共8周。給藥劑量需根據(jù)每周稱取大鼠體質(zhì)量及時(shí)調(diào)整。給藥至第20周結(jié)束后取材。

3 指標(biāo)測(cè)定

3.1肺組織于第20周結(jié)束后取材。10%的中性甲醛固定72h，石蠟包埋，4um切片，常規(guī)HE染色，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察支氣管、肺泡病理變化，并根據(jù)典型而有意義的病理改變進(jìn)行圖像定量分析。

3.2骨骼肌組織形態(tài)學(xué)

10%的中性甲醛將骨骼肌組織固定72h，進(jìn)行石蠟包埋、切片、常規(guī)HE染色，在光鏡下觀察股四頭肌的病理變化。

3.3血漿中LEP含量測(cè)定

LEP濃度采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（EISA）進(jìn)行測(cè)定，單位均為：ng/l。試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作，每個(gè)指標(biāo)測(cè)3次，取均值。

3.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析處理。組間比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以表示。顯著性水準(zhǔn)取a=0.05。

4 結(jié)果

4.1一般情況

模型組大鼠自第2周開始，出現(xiàn)不同程度的躁動(dòng)、皮毛無(wú)光澤，大便溏薄，活動(dòng)量減少等癥狀，各組在用藥治療后上述癥狀均有不同程度的改善，3個(gè)中藥治療組中以補(bǔ)肺健脾方組和補(bǔ)肺益腎方組尤為顯著。

4.2肺組織病理（見圖1）

光鏡下觀察，對(duì)照組肺臟組織大致正常，模型組大鼠肺組織的肺泡間質(zhì)以及肺支氣管可見大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡壁出現(xiàn)斷裂、融合形成氣腔、纖維網(wǎng)被破壞，3個(gè)中藥治療組和氨茶堿組均可一定程度減輕上述病理改變。

4.3股四頭肌病理變化（見圖2）

圖2 第20周各組大鼠股四頭肌病理照片（HE染色）

光鏡下觀察，對(duì)照組股四頭肌肌纖維橫截大致正常，模型組股四頭肌肌纖維橫截面積減少伴有一定程度肌纖維的損壞，3個(gè)中藥治療組和氨茶堿組肌纖維橫截面積較模型組均有所改善，其中以補(bǔ)肺健脾方組較為明顯。

4.4LEP水平（見表3）

表3 各組大鼠血漿中LEP的含量s，n=6）

表3 各組大鼠血漿中LEP的含量s，n=6）

注：與對(duì)照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

對(duì)照組 351.34±67.05模型組 1396.86±299.07**氨茶堿組 570.40±246.71##補(bǔ)肺健脾方組 642.21±290.47#補(bǔ)肺益腎方組 361.44±143.15##益氣滋腎方組 478.50±94.96##

Elisa結(jié)果顯示LEP水平模型組較對(duì)照組有明顯的升高（P＜0.01），在用藥治療后，3個(gè)中藥治療組和氨茶堿組可明顯降低LEP水平(P＜0.05，P＜0.01)。

5 討論

COPD病位在肺，通?？衫奂暗狡⒑湍I；其穩(wěn)定期屬本虛標(biāo)實(shí)，以肺脾腎三臟的虛損較為常見,氣（陽(yáng)）虛、氣陰兩虛是其病機(jī)[12]，主要表現(xiàn)為肺脾氣虛證、肺腎氣虛證、肺腎氣陰兩虛證等[13-14]，并據(jù)此擬定調(diào)補(bǔ)肺腎三方（補(bǔ)肺健脾、補(bǔ)肺益腎、益氣養(yǎng)陰滋腎）。多中心、隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)表明，對(duì)COPD穩(wěn)定期患者，補(bǔ)肺健脾方能夠改善患者肺功能，改善臨床癥狀，提高運(yùn)動(dòng)能力和生活質(zhì)量，延緩和改善骨骼肌萎縮的發(fā)生和發(fā)展等[15]。

慢性支氣管炎、小氣道和小動(dòng)脈重塑、肺氣腫等損傷是COPD主要的病理表現(xiàn)，本研究結(jié)果表明，經(jīng)治療后，較模型組而言，3個(gè)中藥治療組和氨茶堿組可明顯改善支氣管壁增厚、肺泡破裂融合、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等表現(xiàn)；其中3個(gè)中藥組改善肺泡破裂融合較氨茶堿組顯著。

骨骼肌萎縮屬于中醫(yī)學(xué)“痿癥”、“痿壁”等病癥的范疇，是一種可以發(fā)生于多種疾病和狀態(tài)的嚴(yán)重并發(fā)癥，特征是其纖維橫截面積，蛋白質(zhì)含量和強(qiáng)度的降低導(dǎo)致疲勞性增加[16,17]，其機(jī)制可能是由于蛋白質(zhì)降解增加或合成減少或兩者兼而有之[18,19]，影響COPD患者呼吸肌肉和外周肌肉的功能、運(yùn)動(dòng)能力、健康狀態(tài)和預(yù)后。

LEP是一種由脂肪組織分泌的激素，在調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝、體質(zhì)量方面起著重要作用[20]，其主要生理功能為抑制攝食、增加能量消耗、維持正常的血脂代謝。COPD是一種以炎性反應(yīng)為核心的慢性進(jìn)行性的的疾病，COPD肺部炎性反應(yīng)“溢出”，可產(chǎn)生全身炎性反應(yīng)和全身效應(yīng)[21-23]。COPD骨骼肌萎縮患者由于慢性炎癥刺激，炎癥介質(zhì)的增多，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞上的瘦素mRNA表達(dá)增加，從而導(dǎo)致血液循環(huán)中瘦素水平升高[24],在COPD急性加重期患者血液循環(huán)中隨炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度升高，出現(xiàn)高代謝，低攝入的狀況，從而造成患者體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)入不敷出的現(xiàn)象，使骨骼肌質(zhì)量和功能大幅下降[25]。本研究表明，3個(gè)中藥方均可以降低LEP水平，效果優(yōu)于氨茶堿。

綜上所述，調(diào)補(bǔ)肺腎三方對(duì)COPD大鼠骨骼肌萎縮有明顯的療效，表現(xiàn)為改善肺組織和股四頭肌病理?yè)p傷，降低LEP水平。