潘泉君

（北海市疾病預(yù)防控制中心 廣西北海 536000）

1 前言

孔雀石綠（Malachite Green）是有毒的三苯甲烷類化學(xué)物質(zhì)，既是染料，也是殺菌、除寄生蟲的藥物，但具有潛在的致癌作用，在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域是國家明令禁止添加的物質(zhì)[1]。目前，常用于檢測鮮活水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的方法為GB/T 20361—2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定高效液相色譜熒光檢測法》的高效液相色譜熒光檢測法[2]和GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3]。前法所用儀器高效液相色譜較為普及，但前處理所用試劑種類較多、步驟煩瑣，可能導(dǎo)致提取過程中孔雀石綠損失較大；后法前處理較為簡單，但使用的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜較為昂貴，且維護(hù)費用高，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重。故本文結(jié)合上述2種方法的優(yōu)點，對鮮活水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的測定方法進(jìn)行改良。

2 原理

樣品中殘留的孔雀石綠用乙腈提取，氯化鈉使乙腈和水相分層，取乙腈相濃縮后經(jīng)固相萃取柱凈化，液相熒光檢測器檢測，外標(biāo)法定量。

3 材料與方法

3.1 儀器與試劑

儀器：Agilent 1200高效液相色譜儀（FLD檢測器）；Agilent 1260自動進(jìn)樣器、超聲波清洗儀（東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司）；漩渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；感量0.01 g電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（步琦公司）；高速離心機(jī)（山東鑫貝西生物技術(shù)有限公司）。

試劑：色譜純乙腈；分析純氯化鈉；分析純硼氫化鉀（使用時稱取0.405 g溶解于250 mL水中，此時濃度為0.03 mol/L，現(xiàn)配現(xiàn)用）；分析純冰乙酸；分析純無水乙酸銨（使用時稱取9.64 g溶解于1 000 mL水中，此時濃度為0.125 mol/L，冰乙酸調(diào)pH到4.5）；中性氧化鋁柱（CNW 公司，1 g/3 mL）；0.22 μm 濾膜（津騰公司）；100 mg/L乙腈中孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所）。

3.2 方法

3.2.1 樣品處理

將購于水產(chǎn)市場的活魚活蝦去鱗、去皮、去殼，取肌肉部分，將樣品切成直徑不大于0.1 cm的小塊。準(zhǔn)確稱取樣品5.00 g于50 mL具塞離心管中，加入10.0 mL乙腈和適量氯化鈉，渦旋混勻，超聲5min，4 000 r/min離心5 min，取上清液至梨形瓶中，加入10.0 mL乙腈至上述離心管中，搗碎沉淀后再次渦旋混勻，超聲5 min，4 000 r/min離心5 min，合并上清液至梨形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至剩余液體1 mL左右。轉(zhuǎn)移殘液至已用5 mL乙腈活化過的中性氧化鋁柱上，用2.5 mL乙腈洗滌梨形瓶，洗滌液過柱。重復(fù)上述操作1次，收集全部流出液于另一梨形瓶中，再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1mL左右，加入硼氫化鉀溶液（0.03mol/L）0.6mL，乙腈定容至3 mL，過0.22 μm濾膜后進(jìn)樣測定。

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制（表1）

移取100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL至100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，此為標(biāo)準(zhǔn)中間液。移取表1中體積的標(biāo)準(zhǔn)中間液于10mL容量瓶中，各加入硼氫化鉀溶液（0.03 mol/L）2 mL，用乙腈定容至刻度，配制成工作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制一覽表

3.2.3 色譜條件

采用ZORBAX Eplipse XDB-C18色譜柱，柱溫35℃，流速：1.3mL/min，熒光檢測器（FLD）檢測器（激發(fā)波長：265nm，發(fā)射波長：360 nm），流動相為乙腈+乙酸銨緩沖溶液（0.125mol/L，pH4.5）=80+20，進(jìn)樣量 20L。

4 結(jié)果

4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性實驗

分別取溶劑乙腈、孔雀石綠陰性樣品、濃度為5.00 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)液在3.2.3色譜條件下測定，測定譜圖詳見圖1～圖3。在該色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)品峰型良好，乙腈和孔雀石綠陰性樣品在與標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰相應(yīng)的位置上無吸收峰，表明溶劑和樣品基質(zhì)中的其他成分對測定結(jié)果無影響。

圖1 溶劑乙腈圖譜

圖2 孔雀石綠陰性樣品圖譜

圖3 5.00 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)圖譜

4.2 線性關(guān)系考察

按3.2.2下的方法配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，在3.2.3色譜條件下測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果詳見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

4.3 加標(biāo)回收率試驗

稱取上述已測定的陰性魚、蝦樣品各6份，按高、中、低水平做加標(biāo)回收試驗，高、中、低水平的加入量分別為 6.00 ng、15.00 ng、30.00 ng，做平行樣。按3.2.1進(jìn)行樣品處理，以外標(biāo)法進(jìn)行定量計算。加標(biāo)樣品測定圖譜詳見圖4。

4.4 精密度試驗

準(zhǔn)確稱取上述已測定的陰性樣品5.00 g，加入孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)15.00 ng，按3.2.1進(jìn)行樣品處理，由自動進(jìn)樣器連續(xù)進(jìn)樣6次，用測得的峰面積求相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

4.5 檢出限試驗

準(zhǔn)確稱取上述已測定的陰性樣品5.00 g，加入孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)3.00 ng，按3.2.1進(jìn)行樣品處理，以3倍信噪比計算檢出限。加標(biāo)回收率、精密度以及檢出限結(jié)果詳見表3。

圖4 加標(biāo)樣品圖譜

表3 加標(biāo)回收率、精密度及檢出限結(jié)果

5 結(jié)論

（1）本方法準(zhǔn)確快速，減少了國標(biāo)方法前處理的煩瑣操作，降低了實驗所需花費，適用于測定鮮活水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量；（2）氯化鈉需加過量，否則乙腈中殘留水分太多，加入硼氫化鉀溶液后易起泡、易乳化，影響定容體積；（3）不宜將樣品打成泥狀使用，否則易黏結(jié)在一起，不利于樣品均勻地渦旋和超聲。