劉 蕾，楊海鶯，沈雪梅，倪 偉，鄭曉衛(wèi)，陳 博，陳歷水

（1.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209；2.老年?duì)I養(yǎng)食品研究北京市工程實(shí)驗(yàn)室，北京 102209；3.營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102209）

生物胺是一類含氮的低分子質(zhì)量堿性有機(jī)化合物的總稱，普遍存在于中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，過量攝入會(huì)引起不良反應(yīng)。在發(fā)酵食品中，具有氨基酸脫酸酶活性的微生物對(duì)生物胺的形成至關(guān)重要[1-2]。常見的產(chǎn)生物胺的微生物有腸桿菌屬（Enterobacter）、腸球菌屬（Enterococcus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、鏈球菌屬（Streptococcus）、酒球菌屬（Oenococcus）、梭菌屬（Clostridium）和假單胞菌屬（Pseudomonas）等，其中乳酸菌是產(chǎn)生物胺的主要菌種[3-4]。而發(fā)酵肉制品中生物胺的產(chǎn)生主要與微球菌屬（Micrococcus）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）有關(guān)，其中肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）和魚發(fā)酵葡萄球菌（Staphylococcus piscifermentans）具有高氨基酸脫羧酶活性，能夠產(chǎn)生尸胺、2-苯乙胺、腐胺和組胺[5-7]。MARTUSCELLI M等[6]從香腸中分離得到51株木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus），發(fā)現(xiàn)其中的21株有體外氨基酸脫羧酶活性，只有7株菌株的酪胺、亞精胺和精胺產(chǎn)量＞10 mg/kg，未檢測(cè)到組胺的產(chǎn)生[6]。

目前，發(fā)酵食品中生物胺含量主要通過高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography，HPLC）法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法的前處理較為繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)。近年來有學(xué)者利用分子生物學(xué)的方法檢測(cè)微生物中產(chǎn)生物胺的相關(guān)酶的基因判斷其是否產(chǎn)生某種特定的生物胺。此方法具有快速、可靠、不依賴于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，并可在生物胺形成之前，檢測(cè)出產(chǎn)生物胺的基因，因此可分析出潛在的產(chǎn)生物胺危害[8-11]。不同種類的發(fā)酵肉制品中生物胺種類和含量有一定差別[12-13]。其中，酪胺、尸胺和組胺報(bào)道較多。酪胺是由酪氨酸脫羧酶（tyrosine decarboxylase，TDC）催化酪氨酸脫羧形成的；尸胺是由賴氨酸在賴氨酸脫羧酶（lysine decarboxylase，IDC）的催化下脫羧形成的；組胺是毒性最大的生物胺，由組氨酸脫羧酶（histidine decarboxylase，HDC）催化組氨酸脫羧形成的。

本研究以云南臘腸為研究對(duì)象，首先，采用高通量測(cè)序技術(shù)研究發(fā)酵肉制品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性。然后利用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法及雙層顯色培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵肉制品中產(chǎn)生物胺的細(xì)菌進(jìn)行分離篩選，并基于16S rRNA序列進(jìn)行鑒定。最后，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增與測(cè)序的方法對(duì)細(xì)菌中產(chǎn)組胺、酪胺和尸胺的相關(guān)基因進(jìn)行特異性篩選，以期建立發(fā)酵肉制品中生物胺的快速篩選機(jī)制，為基因檢測(cè)技術(shù)在發(fā)酵食品安全性檢測(cè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

云南臘腸：云南市場(chǎng)購買。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，葡萄糖20.0 g，酵母浸粉5.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，無水乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，吐溫80 1.0 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.2 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至6.80。121 ℃高壓滅菌15 min。

MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加20.0 g瓊脂。121 ℃高壓滅菌15 min。

雙層顯色下層培養(yǎng)基[14]：蛋白胨5.0 g，酵母浸粉5.0 g，牛肉膏5.0 g，NaCl 2.5 g，葡萄糖0.5 g，吐溫80 1.0 mL，MgSO40.4 g，MnSO40.03 g，K2HPO42.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，CaCO30.1 g，F(xiàn)eSO40.04 g，維生素B1（vitamin B1，VB1）0.01 g，磷酸吡哆醛0.05 g，瓊脂20.0 g，色氨酸、精氨酸、賴氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸各5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值5.2。雙層顯色上層培養(yǎng)基：溴甲酚紫0.06 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值5.2。121 ℃高壓滅菌15 min，以不加氨基酸的雙層顯色培養(yǎng)基為對(duì)照。

1.1.3 引物

PCR引物見表1[10，15-17]，由北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司合成。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences used in the study

1.1.4 化學(xué)試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、KOD高保真酶、引物、DNA Marker：上海生工生物工程有限公司；Axy Prep DNA凝膠回收試劑盒：德國AXYGEN公司；Quant-iTPicoGreen熒光定量試劑盒：美國Life Technologies公司；TruSeq DNA建庫試劑盒、MiSeq上機(jī)試劑盒：美國Illumina公司。FastPfu Polymerase（5.0 U）、EXTaq酶（5.0 U）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、5×FastPfu buffer、10×EXTaqBuffer：日本TaKaRa公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZDX35BI滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；H1650-W醫(yī)用離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；MG96+型PCR儀：杭州郎基科學(xué)儀器有限公司；JY04S-3C凝膠成像儀、JY300C電泳系統(tǒng)：北京君意電泳設(shè)備有限公司；HH-2恒溫水浴鍋：上海比郎儀器有限公司；625-00203730XL測(cè)序儀：美國ABI公司；810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；SpectraMax M5酶標(biāo)儀：美國MolecularDevice公司；Miseq基因組測(cè)序儀：美國Illumina 公司；QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)：美國Promega公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵肉制品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

（1）PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)序列

采用DNA提取試劑盒提取臘腸的總DNA，以其為模板，采用上游引物338F和下游引物806RPCR擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA的V3-V4區(qū)序列。PCR擴(kuò)增體系：5×FastPfu buffer 4.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs Mix 2.0 μL，上下游引物（5 μmol/L）各0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，模板DNA 10.0 ng，加雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)至終體積為20 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共27個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。使用Axy Prep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

（2）文庫構(gòu)建和高通量測(cè)序

根據(jù)電泳結(jié)果，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，采用TruSeq DNA建庫試劑盒構(gòu)建文庫。采用Miseq平臺(tái)雙端PE 300測(cè)序策略，使用上機(jī)試劑盒將文庫加入Miseq測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

（3）生物信息學(xué)分析和數(shù)據(jù)分析

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾拼接處理后，得到優(yōu)化序列。在97%的相似水平下，利用vsesion 7.1 Usearch（http：//drive5.com/uparse/）軟件平臺(tái)，劃分可操作分類單元（operational taxonomicunit，OTU），并挑取OTU的代表序列。采用RDPclassifier貝葉斯算法，設(shè)置置信度閾值為0.7，基于Silva數(shù)據(jù)庫（http：//www.arb-silva.de）對(duì)OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并在屬水平上統(tǒng)計(jì)樣品的細(xì)菌群落組成。

1.3.2 發(fā)酵肉制品中產(chǎn)生物胺細(xì)菌的篩選與鑒定

（1）細(xì)菌的分離純化

取臘腸1.0 g于9.0 mL無菌生理鹽水中，充分振蕩，用無菌生理鹽水梯度稀釋（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），并涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h。根據(jù)菌落形態(tài)、大小、顏色等挑取單菌落，-20 ℃保藏。

（2）產(chǎn)生物胺細(xì)菌的篩選

將分離純化的菌株接種到雙層顯色下層培養(yǎng)基上，37℃條件下培養(yǎng)48 h，無菌條件下，在下層培養(yǎng)基上倒一層上層培養(yǎng)基（50 ℃），顯色，并在5 min內(nèi)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以不接種菌株的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，顯紫色的為陽性（產(chǎn)生物胺菌），不變色即黃色為陰性（不產(chǎn)生物胺菌）[18-19]。

（3）產(chǎn)生物胺細(xì)菌的鑒定

將產(chǎn)生物胺菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)12 h，取1 mL菌液，10 000 r/min離心1 min，棄上清，取菌體沉淀，參照DNA提取試劑盒的步驟提取基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，于-20 ℃條件下保存。以提取的DNA為模板，采用引物27F及1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：10×ExTaqbuffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs Mix 4.0 μL，上下游引物各2.0 μL，ExTaq酶0.5 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH2O補(bǔ)至終體積為50μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1.5min，共24個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，送去北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)搜索。

1.3.3 產(chǎn)生物胺細(xì)菌功能基因的擴(kuò)增及測(cè)序

選擇產(chǎn)生物胺能力較強(qiáng)的菌株（選擇雙層顯色培養(yǎng)基中紫色較深的菌株），進(jìn)行功能基因檢測(cè)。PCR擴(kuò)增：以提取的細(xì)菌基因組DNA為模板，采用表1中的引物PCR擴(kuò)增ldc、hdc和tdc基因片段。PCR擴(kuò)增體系：10×ExTaqBuffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs Mix 4.0 μL，上下游引物各2.0 μL，ExTaq酶0.5 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH2O補(bǔ)至終體積為50 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，hdc基因48 ℃退火45 s、ldc基因50 ℃退火45 s、tdc基因50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

系統(tǒng)進(jìn)化分析：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送去北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)搜索，選取與序列具有同源性該菌屬內(nèi)有代表性的多種模式菌株基因序列，利用MEGA7.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，其中Bootsdrap 1 000次檢驗(yàn)進(jìn)化樹置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵肉制品中微生物群落結(jié)構(gòu)分析

通過高通量測(cè)序技術(shù)分別對(duì)發(fā)酵肉制品樣本中細(xì)菌的16S rRNA V3-V4區(qū)序列進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過濾拼接處理后得到細(xì)菌序列72 835條，樣品質(zhì)控Q20＞96%，Q30＞89%（Q20和Q30是堿基質(zhì)量值，其中Q20為堿基識(shí)別出錯(cuò)率為1/100，堿基識(shí)別精度為0.99；Q30為堿基識(shí)別出錯(cuò)率為1/1 000，堿基識(shí)別精度為0.999），發(fā)酵肉制品樣品稀釋曲線見圖1。

圖1 發(fā)酵肉制品中細(xì)菌多樣性測(cè)序稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve for the bacteria diversity sequencing of fermented meat sample

由圖1可知，隨著測(cè)序數(shù)量的增加，OUT數(shù)先急劇增加后趨于平緩，說明測(cè)序質(zhì)量和測(cè)序深度均滿足實(shí)驗(yàn)需求，可用于后續(xù)結(jié)果分析。在97%的相似水平下對(duì)OTU進(jìn)行分類學(xué)分析，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，發(fā)酵肉制品樣本中細(xì)菌98.59%為厚壁菌門（Firmicutes）的葡萄球菌屬（Staphylococcus）。傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品的加工過程均有微生物參與，但由于不同發(fā)酵肉制品的不同原料、地區(qū)來源、加工工藝、貯藏條件等使最終產(chǎn)品中微生物組成有較大差別。我國傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中較常見的微生物有腸細(xì)菌（Enterobacteria）、乳酸菌、葡萄球菌（Staphylococcus）和嗜冷桿菌（Psychrobacter）的某些種，國外的發(fā)酵香腸中分離出的微生物主要有腸細(xì)菌、乳酸菌、葡萄球菌、肉桿菌（Carnobacterium）以及酵母菌的某些種[20-21]。

圖2 基于屬水平發(fā)酵肉制品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Bacterial community structure in fermented meat based on genus level

2.2 發(fā)酵肉制品中產(chǎn)生物胺細(xì)菌的篩選與鑒定

通過傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法從發(fā)酵肉制品中共分離得到52株細(xì)菌，通過雙層顯色培養(yǎng)基從中篩選到43株產(chǎn)生物胺的陽性菌株。通過PCR擴(kuò)增獲得43株菌株的16S rRNA序列，在NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見表2。

表2 發(fā)酵肉制品中產(chǎn)生物胺細(xì)菌16S rRNA序列比對(duì)結(jié)果Table 2 Alignment results of 16S rRNA sequences of biogenic amines-producing bacteria in fermented meat

續(xù)表

由表2可知，發(fā)酵肉制品中產(chǎn)生物胺的細(xì)菌主要為表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）。有報(bào)道稱，葡萄球菌在發(fā)酵肉制品中主要產(chǎn)生蛋白酶和脂肪酶，對(duì)發(fā)酵肉制品的風(fēng)味形成和色澤穩(wěn)定起重要作用[22]。另外，有報(bào)道稱，表皮葡萄球菌可產(chǎn)生生物胺氧化酶，對(duì)已產(chǎn)生的生物胺進(jìn)行降解，從而降低生物胺的積累[20]。在本研究中，表皮葡萄球菌可能對(duì)發(fā)酵肉制品的品質(zhì)有促進(jìn)作用，同時(shí)也是產(chǎn)生物胺的主要微生物。

2.3 發(fā)酵肉制品中產(chǎn)生物胺細(xì)菌功能基因檢測(cè)

2.3.1 賴氨酸脫羧酶編碼基因ldc的確定與分析

在產(chǎn)生物胺微生物的分離過程中，利用的是雙層顯色培養(yǎng)基法。在顯色過程中，不同產(chǎn)生物胺的微生物顯示紫色的能力有顯著差別，選擇產(chǎn)紫色較深的微生物即生物胺產(chǎn)生能力較強(qiáng)的微生物（菌株5、8、10、12、21、31和45），進(jìn)行功能基因檢測(cè)。采用革蘭氏陽性菌的賴氨酸脫羧酶引物L(fēng)DC1和LDC2 PCR擴(kuò)增以上7株菌株的ldc基因，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，7株細(xì)菌PCR擴(kuò)增后均出現(xiàn)陽性條帶。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序及序列比對(duì)顯示，7株細(xì)菌的ldc基因序列與表皮葡萄球菌賴氨酸脫羧酶基因序列的一致性＞97%。選取同源性較高的該菌屬內(nèi)有代表性的多種模式菌株的ldc基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖4。

圖3 發(fā)酵肉制品中產(chǎn)生物胺細(xì)菌賴氨酸脫羧酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 PCR products of lysine decarboxylase gene of biogenic amines-producing bacteria in fermented meat

圖4 基于賴氨酸脫羧酶基因產(chǎn)生物胺細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of biogenic amines-producing bacteria based on lysine decarboxylase gene

由圖4可知，同一菌種來源的賴氨酸脫羧酶相似性較高，因此，本研究中采用的引物及PCR擴(kuò)增條件可用于表皮葡萄球菌中賴氨酸脫羧酶基因的檢測(cè)。

2.3.2 組氨酸脫羧酶編碼基因hdc的確定與分析

采用革蘭氏陽性菌的組氨酸脫羧酶引物HDC1和HDC2 PCR擴(kuò)增菌株5、8、10、12、21、31和45的hdc基因，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，7株細(xì)菌PCR擴(kuò)增后均出現(xiàn)陽性條帶，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序及序列比對(duì)顯示，7株細(xì)菌的hdc基因序列與表皮葡萄球菌的組氨酸脫羧酶基因序列的一致性＞98%。選取同源性較高的該菌屬內(nèi)有代表性的多種模式菌株的hdc基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖6。

圖5 發(fā)酵肉制品中產(chǎn)生物胺細(xì)菌組氨酸脫羧酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.5 PCR products of histidine decarboxylase gene of biogenic amines-producing bacteria in fermented meat

圖6 基于組氨酸脫羧酶基因產(chǎn)生物胺細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of biogenic amines-producing bacteria based on histidine decarboxylase gene

由圖6可知，不同菌種來源的組氨酸脫羧酶的相似性較高。因此，本研究中采用的引物及PCR擴(kuò)增條件不僅可用于表皮葡萄球菌中組氨酸脫羧酶基因的檢測(cè)，還可擴(kuò)展到其他菌種來源的組氨酸脫羧酶基因檢測(cè)。

2.3.3 酪氨酸脫羧酶編碼基因tdc的確定與分析

利用酪氨酸脫羧酶引物TDC1和TDC2 PCR擴(kuò)增菌株5、8、10、12、21、31和45的酪氨酸脫羧酶基因，結(jié)果見圖7。

圖7 發(fā)酵肉制品中產(chǎn)生物胺細(xì)菌酪氨酸脫羧酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.7 PCR products of tyrosine decarboxylase gene of biogenic amines-producing bacteria in fermented meat

由圖7可知，只有菌株12和21 PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)了陽性條帶。陽性條帶經(jīng)測(cè)序及序列比對(duì)顯示，上述菌株基因序列與表皮葡萄球菌酪氨酸脫羧酶基因序列的一致性＞98%。由于本研究中采用的引物擴(kuò)增效果較差，因此，后期需進(jìn)行PCR擴(kuò)增引物的篩選以及擴(kuò)增條件的改變，以找到適合表皮葡萄球菌酪氨酸脫羧酶基因檢測(cè)的引物及條件。

3 結(jié)論

通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)發(fā)酵肉制品中細(xì)菌的16S rRNA V3-V4區(qū)序列進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明，發(fā)酵肉制品中細(xì)菌主要為厚壁菌門（Firmicutes）的葡萄球菌屬（Staphylococcus）。通過傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法從發(fā)酵肉制品中共分離得到52株細(xì)菌，利用雙層顯色培養(yǎng)基從中篩選出43株產(chǎn)生物胺細(xì)菌，且主要為表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis），與細(xì)菌多樣性結(jié)果一致。對(duì)7株高產(chǎn)生物胺的表皮葡萄球菌的賴氨酸脫羧酶、組氨酸脫羧酶和酪氨酸脫羧酶編碼基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，7株表皮葡萄球菌均含有基因hdc和ldc，為兩種生物胺的快速檢測(cè)提供理論基礎(chǔ)。