向凡舒，梅 洋，鄧長(zhǎng)陽(yáng)，王彥杰，郭 壯，2，侯強(qiáng)川

（1.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 襄陽(yáng) 441053；2.恩施市公共檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北 恩施 445000）

利川腌菜原材料主要是俗稱“瓢兒菜”或“疙瘩菜”的大青菜，經(jīng)晾曬清洗后加入鹽、辣椒和大蒜等調(diào)味料后，裹扎放入壇中壓緊封壇，大約一個(gè)月后方可食用，并且隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)，味道越濃郁美味。目前我國(guó)蔬菜腌制品的發(fā)酵大多借助天然附著在蔬菜表面微生物的作用進(jìn)行[1]，腌菜生產(chǎn)過程中，微生物活動(dòng)不僅影響腌菜發(fā)酵時(shí)間，對(duì)腌菜風(fēng)味物質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分形成也有重要作用[2]。準(zhǔn)確揭示不同腌菜的菌群組成及其與腌菜風(fēng)味之間的關(guān)系，對(duì)于腌菜的規(guī)?；a(chǎn)具有重要意義。分子生物學(xué)方法的興起擴(kuò)大了人們對(duì)發(fā)酵蔬菜中微生物的認(rèn)識(shí)，PLENGVIDHYA V等[3]在工業(yè)蔬菜發(fā)酵液中利用脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）指紋圖譜鑒定到686株乳酸菌。尚雪嬌等[4]以恩施地區(qū)腌菜為研究對(duì)象，使用變性梯度凝膠電泳結(jié)合高通量測(cè)序的方法探究了樣品中乳酸菌和細(xì)菌的多樣性。顏娜等[5]采用高通量測(cè)序技術(shù)解析了恩施地區(qū)酸蘿卜中的細(xì)菌組成。二代高通量測(cè)序技術(shù)以無需培養(yǎng)和檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品微生物多樣性的研究中，其中16S rRNA是鑒定樣品中細(xì)菌微生物組成的主要方法，大量細(xì)菌微生物多樣性的研究以樣品宏基因組DNA 16S rRNA單可變區(qū)或多可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序[6-7]，以全面解析樣品中菌群的組成。此外，腌菜的風(fēng)味是影響腌菜質(zhì)量的重要因素之一[8]，微生物通過代謝活動(dòng)，可以產(chǎn)生糖、酸、醇、酯、氨基酸等產(chǎn)物[9]，賦予腌菜各具特色的風(fēng)味。而通過電子鼻技術(shù)可有效揭示樣品中不同揮發(fā)性物質(zhì)的濃度，目前該技術(shù)已廣泛用于不同發(fā)酵食品中揮發(fā)性物質(zhì)的檢測(cè)中[10-12]。

本研究采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)和電子鼻技術(shù)相結(jié)合的方法，全面解析了利川腌菜中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)和風(fēng)味組成，同時(shí)分析了兩者之間的相關(guān)關(guān)系，以期為全面掌握發(fā)酵蔬菜中細(xì)菌和風(fēng)味組成及改進(jìn)發(fā)酵蔬菜的制作工藝提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

從湖北省恩施土家苗族自治州利川市采集十份腌菜樣品，其中樣品LCYC1～LCYC3采集自南門菜市場(chǎng)、LCYC4～LCYC6采集自解放東路菜市場(chǎng)、LCYC7～LCYC10采集自大北門農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。所有樣品外觀無明顯差異，制作原料為利川市本地產(chǎn)大青菜，制作地點(diǎn)在利川市本地，所有樣品無明顯異味和霉斑且制作時(shí)間均在1個(gè)月左右。

1.1.2 試劑

qiagen69514食品基因組DNA提取試劑盒：德國(guó)QIAGEN公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）Mix、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）緩沖液（10×）、DNA聚合酶（5 U/μL）：北京全式金生物技術(shù)有限公司；16S rRNA V1～V3區(qū)引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

CT15RE臺(tái)式冷凍離心機(jī)：日本HITACHI公司；2100芯片生物分析儀：美國(guó)Agilent公司；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)：美國(guó)Nano Drop公司；vetiri梯度基因擴(kuò)增儀：美國(guó)AB公司；FluorChem FC3化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Fluor Chem公司；MiseqPE300高通量測(cè)序平臺(tái)：美國(guó)Illumina公司；R920機(jī)架式服務(wù)器：美國(guó)DELL公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品DNA提取和16S rRNA V1～V3區(qū)序列擴(kuò)增

按照qiagen69514食品基因組DNA提取試劑盒說明書步驟進(jìn)行10份利川腌菜樣品的宏基因組DNA提取，使用V1～V3區(qū)域引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和338R（5'-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3'）對(duì)樣品V1～V3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（20μL）：10×PCR緩沖液（含Mg2+）4 μL，dNTPs Mix（2.5 mmol/L）2 μL，正反向引物（5 μmol/L）0.8 μL，DNA聚合酶0.4 μL，DNA模板10 ng，雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)充至20 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃末端延伸10 min。

1.3.2 基于電子鼻對(duì)樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

稱取10 g腌菜于樣品瓶中，60 ℃水浴保溫20 min后室溫平衡10 min，采用頂空吸氣法，進(jìn)樣吸氣流量200 mL/min，傳感器清潔95 s（如果發(fā)現(xiàn)曲線不平或離基線遠(yuǎn)可再清洗一遍或直接增加清洗時(shí)間），樣品準(zhǔn)備時(shí)間5 s，測(cè)定時(shí)間60 s，選取49 s、50 s和51 s時(shí)的響應(yīng)值求取平均值進(jìn)行分析，樣品間間隔1.5 min。該電子鼻中包含10個(gè)金屬氧化物傳感器陣列，用于分析物質(zhì)中不同揮發(fā)性成分，傳感器陣列及性能描述見表1。

表1 傳感器陣列及性能描述Table 1 Sensor array and performance description

1.3.3 細(xì)菌多樣性分析

對(duì)測(cè)序后的序列進(jìn)行質(zhì)控（目的片段長(zhǎng)度＞300 bp，引物和標(biāo)簽序列完全匹配，整條序列質(zhì)量＞20 的堿基所占比例須＞93%），使用QIIME數(shù)據(jù)分析（V1.7）平臺(tái)參照CAPORASO J G等[13]的方法對(duì)高質(zhì)量序列進(jìn)行后續(xù)分析，以97%相似度劃分操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），選取每一OTU的代表性序列使用Greengenes（V13.8）和核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)（ribosomal database project，RDP）（V11.5）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)，統(tǒng)計(jì)樣品中細(xì)菌在各分類學(xué)水平上的菌群組成。

由表2可知，在1h時(shí)12T-103菌株對(duì)Cry1Ac蛋白降解降較為明顯，由15. 95 μg·L-1降低至0. 68 μg·L-1，降低程度達(dá)極顯著水平(p<0. 01)，其降解率達(dá)92. 26%，此后12T-103菌株對(duì)Cry1Ac蛋白降解較為緩慢且不顯著。由此，12T-103菌株對(duì)Cry1Ac蛋白的降解能力較強(qiáng)。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin（V8.6）軟件和R語(yǔ)言軟件（v3.3.2）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的分析和可視化。使用非參數(shù)的Kruskal-Wallis和Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)分別對(duì)多組和兩組樣品進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 利川腌菜樣品中細(xì)菌豐富度及多樣性分析

對(duì)10份腌菜樣品細(xì)菌16S rRNA基因序列V1～V3區(qū)進(jìn)行Miseq高通量測(cè)序，通過α多樣性曲線評(píng)估各樣品測(cè)序量是否足夠及細(xì)菌微生物多樣性，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，10份腌菜的稀疏曲線均未達(dá)到平臺(tái)期，表明隨著測(cè)序量增大仍然會(huì)發(fā)現(xiàn)新物種，但香農(nóng)曲線已經(jīng)到達(dá)平臺(tái)期，說明隨著測(cè)序量增加細(xì)菌多樣性基本不發(fā)生變化，當(dāng)前測(cè)序量已足以揭示樣品中主要菌群的組成。

利川腌菜的測(cè)序序列信息和α多樣性指數(shù)如表2所示。由表2可知，共得到341 560條高質(zhì)量序列，平均每份樣品34 156條序列（15 927～52 610條），對(duì)這些代表性序列在97%相似度水平上劃分OTU，共獲得14 228個(gè)典型OTU，平均每份樣品3 843個(gè)OTU（1 001～6 671）。

圖1 各樣品細(xì)菌組成的稀疏曲線（a）和香農(nóng)曲線（b）Fig.1 Rarefaction curve (a) and Shannon curve (b) of bacteria compositions in each sample

表2 利川腌菜樣品中細(xì)菌群落多樣性和豐富度分析Table 2 Analysis of bacterial community diversity and abundance of Lichuan pickles samples

2.2 利川腌菜中細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)分析

分別在門和屬的水平對(duì)利川腌菜中的細(xì)菌組成進(jìn)行了注釋和分析。在門水平，所有樣品共注釋到13個(gè)細(xì)菌門，平均每個(gè)樣品可檢測(cè)到9.0±2.5個(gè)細(xì)菌門，結(jié)果如圖2a所示。由圖2a可知，其中平均相對(duì)含量＞1%的菌門有4個(gè)，分別為厚壁菌門（Firmicutes）（44.4%）、變形菌門（Proteobacteria）（40.4%）、放線菌門（Actinobacteria）（13.5%）和擬桿菌門（Bacteroidetes）（1.5%），雖然各樣品門水平組成不盡相同，但各樣品優(yōu)勢(shì)菌門一致。

圖2 基于門水平（a）和屬水平（b）利川腌菜樣品中菌群組成Fig.2 Compositions of microbiota at phylum (a) and genus (b) level in different Lichuan pickles samples

由圖2b可知，在屬水平，所有樣品共注釋到386個(gè)屬，平均每個(gè)樣品可檢測(cè)到（210±59）個(gè)細(xì)菌屬。其中12個(gè)菌屬的平均相對(duì)含量＞1%，主要包括乳桿菌屬（Lactobacillus，17.1%），棒狀桿菌屬（Corynebacterium，10.5%），假單胞菌屬（Pseudomonas，9.5%），芽孢桿菌屬（Bacillus，7.6%），嗜冷桿菌屬（Psychrobacter，6.4%），弧菌屬（Vibrio，4.9%），葡萄球菌屬（Staphylococcus，4.3%），魏斯氏菌屬（Weissella，4.1%），鹽單胞菌（Halomonas，1.9%），大洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus，1.6%），四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus，1.2%）和普羅維登斯菌屬（Providencia，1.2%）。不同樣品的優(yōu)勢(shì)屬亦存在一定的差異，如樣品LCYC5、LCYC6和LCYC7中乳桿菌屬的相對(duì)含量較高，樣品LCYC4和樣品LCYC6中芽孢桿菌屬的相對(duì)含量較高，而樣品LCYC7、LCYC8和LCYC10分別擁有較高數(shù)量的弧菌屬、假單胞菌屬和嗜冷桿菌屬。利川腌菜樣品菌群在屬水平存在著較大差異，但導(dǎo)致菌群差異的具體原因尚不是十分清楚，推測(cè)可能與利川腌菜多由自家生產(chǎn)，非工業(yè)化統(tǒng)一生產(chǎn)有關(guān)。

2.3 利川腌菜樣品中細(xì)菌菌群差異性分析

對(duì)測(cè)序獲得的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行Beta多樣性分析，分別基于加權(quán)和非加權(quán)Unifrac距離對(duì)10份腌菜樣品進(jìn)行了主坐標(biāo)分析，以直觀的方式展現(xiàn)不同樣品間菌群的差異和相似性，結(jié)果見圖3。

2.4 利川腌菜中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

電子鼻技術(shù)是基于氣體傳感陣列響應(yīng)圖譜來識(shí)別氣味的電子系統(tǒng)，廣泛應(yīng)用于風(fēng)味物質(zhì)的分析檢測(cè)中[15-16]。本實(shí)驗(yàn)使用該技術(shù)對(duì)10份利川樣品風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，各樣品風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果見表3。

由表3可知，利川腌菜樣品間不同風(fēng)味的響應(yīng)值存在較大差異，整體而言，利川腌菜中W5S、W1S、W1W和W2S的響應(yīng)值最高，平均響應(yīng)值分別為44.83、79.90、52.04和43.25，表明腌菜風(fēng)味物質(zhì)中氮氧化合物、甲烷、萜類化合物和乙醇較豐富。萜類化合物在酸和酶水解作用下易形成游離態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)，從而賦予產(chǎn)品香氣。此外，該物質(zhì)香氣閾值低，在低濃度下可對(duì)產(chǎn)品香氣產(chǎn)生較大影響[17]。醇類物質(zhì)主要來源于微生物酒精發(fā)酵，使產(chǎn)品具有輕快醇香味[18]。相反，W1C、W3C和W5C的響應(yīng)值較小，平均響應(yīng)值僅為0.10、0.17和0.18，表明利川腌菜中芳香類物質(zhì)含量較低。

表3 利川腌菜樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)電子鼻傳感器響應(yīng)值Table 3 Flavor response value of volatile flavor compounds in Lichuan pickles samples

2.5 利川腌菜中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)差異分析

主成分分析展現(xiàn)了不同樣品間的風(fēng)味差異，結(jié)果見圖4。由圖4可知，10份樣品大致分為3簇，其中樣品LCYC3單獨(dú)為一簇（組1），樣品LCYC2和LCYC5（組2）為一簇，其余樣品為一簇（組3）。對(duì)上述3組樣品的風(fēng)味響應(yīng)值統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見圖5。

圖4 基于主成分分析利川腌菜樣品中風(fēng)味響應(yīng)值差異分析Fig.4 Difference analysis of flavor response value of Lichuan pickles samples based on principal component analysis

圖5 基于主坐標(biāo)聚類的利川腌菜樣品風(fēng)味響應(yīng)值差異分析Fig.5 Difference analysis of flavor response value of three groups of Lichuan pickles samples based on principal coordinate clustering

由圖5可知，三組樣品存在較大差異的風(fēng)味是W5S、W1S、W1W和W2S，分別代表氮氧化合物、甲烷、萜類化合物和乙醇，上述風(fēng)味在組1中的響應(yīng)值分別為134.37、229.22、99.40和190.04；組2中的響應(yīng)值分別為10.67、20.04、23.85和5.57；組3中的響應(yīng)值分別為41.79、75.67、53.33和33.04。說明這四種風(fēng)味物質(zhì)對(duì)利川腌菜整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)較大。

2.6 菌群結(jié)構(gòu)與揮發(fā)性物質(zhì)相關(guān)性分析

由菌群結(jié)構(gòu)分析和風(fēng)味物質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，不同樣品菌群結(jié)構(gòu)和風(fēng)味物質(zhì)之間都存在較大的差異。因此，本研究將相對(duì)含量＞0.5%的菌屬與風(fēng)味響應(yīng)值之間進(jìn)行了Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果見圖6。由圖6可知，部分菌群與風(fēng)味響應(yīng)值之間存在顯著相關(guān)性：其中變形桿菌與W3S、W2W、W6S、W2S、W5S、W1S和W1W呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與W3C、W5C、W1C等芳香類風(fēng)味響應(yīng)值呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；嗜冷桿菌屬與W3S和W6S呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；而腸球菌屬與W2W、W2S和W5S呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），眾多研究者認(rèn)為腸球菌廣泛存在于發(fā)酵食品中，不僅影響食品的風(fēng)味、香氣和質(zhì)地，還可產(chǎn)生乙醇、過氧化氫等物質(zhì)[19-20]，這與本研究結(jié)果一致。此外，風(fēng)味響應(yīng)值W5S、W1S、W1W和W2S與樣品中70.4%相對(duì)含量＞0.5%的菌屬如腸球菌屬、弧菌屬、芽孢桿菌屬等存在正相關(guān)關(guān)系，與之相反，風(fēng)味響應(yīng)值W1C、W3C和W5C則與上述菌群存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，盡管上述相關(guān)性均不顯著。可能在這些菌屬的共同作用下，最終發(fā)酵蔬菜產(chǎn)品中上述響應(yīng)值對(duì)應(yīng)的氮氧化合物、甲烷、萜類化合物和醇類物質(zhì)的含量較高，而芳香類物質(zhì)含量較低。相關(guān)性分析結(jié)果表明發(fā)酵利川腌菜中風(fēng)味物質(zhì)受多種微生物共同作用的影響，而非單一微生物發(fā)酵產(chǎn)生。

圖6 主要細(xì)菌屬與風(fēng)味響應(yīng)值相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between major bacterial genera and flavor response value

3 結(jié)論

本研究以利川地區(qū)腌菜為研究對(duì)象，利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)和電子鼻技術(shù)全面解析腌菜中細(xì)菌多樣性及其風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其細(xì)菌門主要為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），主要細(xì)菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）和假單胞菌屬（Pseudomonas）。利川腌菜中氮氧化合物、甲烷、萜類化合物和乙醇對(duì)利川腌菜整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)較大。不同樣品細(xì)菌組成和風(fēng)味物質(zhì)存在差異，腌菜中菌群的組成與腌菜風(fēng)味之間存在密切聯(lián)系，提示在腌菜的工業(yè)化生產(chǎn)過程中需要密切關(guān)注發(fā)酵罐中腌菜的菌群的組成。