李恩燦，范瀟予，林 琳，郝瑞瑞，林 生，賀玖明，靳洪濤,3*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，北京 100050；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050；3.北京協(xié)和建昊醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司，北京 100176)

I型超敏反應(yīng)又稱速發(fā)型超敏反應(yīng)(immediate hypersensitivity)，主要由特異性IgE抗體介導(dǎo)，高親和力的IgEFc受體(FcεRI)是反應(yīng)發(fā)生的重要膜分子，其中肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面含有大量的FcεRI[1]。I型超敏反應(yīng)通常包含兩個(gè)階段，即致敏階段和激發(fā)階段。當(dāng)抗原初次進(jìn)入機(jī)體后，初次應(yīng)答產(chǎn)生的IgE抗體與細(xì)胞膜表面FcεRI高親和力的結(jié)合，使細(xì)胞處于致敏階段。當(dāng)相同的抗原再次入侵時(shí)，與細(xì)胞膜上的IgE抗體結(jié)合，致使相鄰的FcεRI發(fā)生橋連，從而觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列的生物化學(xué)反應(yīng)[1]。

5-羥甲基糠醛(5-HMF, C3H6O3)是由一個(gè)呋喃環(huán)組成的小分子化合物，六碳糖在高溫的條件下發(fā)生美拉德反應(yīng)可生成5-HMF[2-3]。5-HMF通常被認(rèn)為是高溫滅菌過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物[4]，存在于各種含糖類的食品和藥物制劑中。此外，5-HMF在高溫下易通過聚合反應(yīng)生成其二聚體產(chǎn)物，即雙(5-甲酰基糠醛)醚(OMBF)。本實(shí)驗(yàn)室前期通過報(bào)告抗原腘窩淋巴結(jié)試驗(yàn) (RA-PLNA)證實(shí)，5-HMF和OMBF可誘導(dǎo)小鼠發(fā)生免疫反應(yīng)[5]。基于先前關(guān)于5-HMF和OMBF的研究,本研究將進(jìn)一步對(duì)5-HMF及OMBF的免疫毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)并初步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無特定病原體(SPF)級(jí)的6周齡雄性Brown Norway(BN)大鼠21只，(170 ± 20)g，購自維通利華生物技術(shù)公司[SCXK(京)2016-0006]。將其隨機(jī)分為不同的給藥組及對(duì)照組。在實(shí)驗(yàn)之前，使大鼠在含有玉米芯的聚碳酸酯籠中適應(yīng)環(huán)境一周，并且可以自由獲取通過反滲透系統(tǒng)凈化的水和實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物飼料，環(huán)境溫度為(23 ± 2)℃，相對(duì)濕度為(50 ± 5)%，12 h光照/黑暗循環(huán)。動(dòng)物飼養(yǎng)于北京協(xié)和建昊醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司動(dòng)物中心[SYXK(京)2015-0021]，該設(shè)施已經(jīng)通過AAALAC認(rèn)證。動(dòng)物處理程序經(jīng)北京協(xié)和建昊醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理委員會(huì)批準(zhǔn)文號(hào)：2018-002(研)。實(shí)驗(yàn)期間按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.1.2 細(xì)胞系

大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞系(RBL-2H3)購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心

1.2 主要試劑與儀器

卵清白蛋白、弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑、5-HMF(CAS：67-47-0；純度：99%)、4-硝基苯-N-乙酰基-β-D-氨基糖苷酶、1,2-苯二甲醇(CAS：612-14-6；純度：97%)、Anti-DNP-IgE、DNP-HSA、二甲基亞砜(DMSO，細(xì)胞培養(yǎng)級(jí))均購自Sigma-Aldrich公司(美國)；MEM/DMEM培養(yǎng)基、谷氨酰胺、非必須氨基酸、丙酮酸鈉、胰酶溶液0.25%、胎牛血清、PBS均購自Thermo Fisher 公司(美國)；甲醇、二甲苯、乙醇、鹽酸(36%～38%)、氫氧化鈉(≥99.8%)、碳酸氫鈉(≥99.8%)、碳酸鈉(≥99.8%)、檸檬酸(≥99.8%)、檸檬酸鈉(≥99.8%)均購自北京化工廠(中國)；ELISA試劑盒包括大鼠IgE、IgG、白細(xì)胞介素-4 (IL-4)、C5b-9、谷胱甘肽過氧化物酶-1(Gpx-1)等指標(biāo)均購自深圳達(dá)科為有限公司(深圳)；Western blot所用抗體購自Cell Signaling Technology (美國)；PierceTMBCA蛋白檢測(cè)試劑盒等其他Western blot相關(guān)試劑均來源于Thermo Fisher公司(美國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞系(RBL-2H3)培養(yǎng)在10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中，加入100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素。將細(xì)胞在37℃，5% CO2的條件下在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 OMBF的制備

使用Larousse概述的程序[6]制備OMBF，純度大于98%，采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。OMBF: m.p. 110℃～112℃;1 hNMR (500 MHz, CDCL3) δ: 9.66 (2 H, S, 2CH=O), 7.26 (2H, d,J=3.5 Hz), 6.61 (2 H, d,J=3.5 Hz), 4.65 (4 H, S, -CH2OCH2-); ESIMSm/z235 [M+H]+。OMBF的制備與鑒定由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所林生研究員課題組完成。

1.3.3 劑量選擇

根據(jù)中國藥典，5%葡萄糖注射液中5-HMF含量不應(yīng)超過11.8 μg/mL[7]。根據(jù)每天最大輸注量為2000 mL，5%葡萄糖注射液中5-HMF的限量為每人每天23.6 mg。使用體表面積系數(shù)公式將人體數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為大鼠，大鼠的等效劑量為2.5 mg/kg。在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究選擇5 mg/kg為低劑量，25 mg/kg為高劑量進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果(數(shù)據(jù)未展示)，本研究選擇0.0502 mM、0.502 mM為5-HMF的低、高劑量，表示為5-HMF-L、5-HMF-H；0.0338 mM、0.338 mM為OMBF的低、高劑量，表示為OMBF-L、OMBF-H。選擇作用時(shí)長為1 h，在該時(shí)間范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率與正常未加藥組無顯著性差異。

1.3.4 Ⅰ型超敏反應(yīng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將21只SPF雄性BN大鼠隨機(jī)按體重分為7組，分別為生理鹽水對(duì)照組(NS)，佐劑對(duì)照組(Adj.)，卵清白蛋白組(Model)，5-HMF-L，5-HMF-H，OMBF-L和OMBF-H。在適應(yīng)環(huán)境一周后，于第1天、第3天和第5天，給藥組每天一次尾靜脈注射藥物，使動(dòng)物致敏。于第19天，腹主動(dòng)脈采血，離心取血清，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。對(duì)照組給予0.9%生理鹽水，使用弗氏完全佐劑(FCA)對(duì)給藥組BN大鼠進(jìn)行第一次致敏和刺激，使用弗氏不完全佐劑(FICA)進(jìn)行第二次和第三次致敏。陽性藥組大鼠給予5%卵清白蛋白溶液(致敏濃度2.5 mL/kg)致敏。給藥組將相應(yīng)濃度的5-HMF和OMBF溶液與等體積的佐劑混合并尾靜脈給藥，激發(fā)劑量是致敏劑量的兩倍。

給藥30 min后用1%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血并收集到含有凝血?jiǎng)┑睦鋬龉苤小?500 r/min，4℃離心10 min，分離血清，-20℃保存，一個(gè)月內(nèi)進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

1.3.5 Ⅰ型超敏反應(yīng)體外實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

大鼠含藥血清的制備與I型超敏反應(yīng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)前期步驟相同，但是沒有經(jīng)過激發(fā)直接腹主動(dòng)脈采集血清，并用ELISA試劑盒檢測(cè)IgE濃度。

取RBL-2H3對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，每毫升1×105個(gè)，接種到24孔板內(nèi)。5% CO2，37℃孵化后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組，佐劑對(duì)照組，裂解組，模型組(Anti-IgE-DNP為抗體，以DNP-BSA為抗原)，5-HMF組(低、高)，OMBF組(低、高)。待細(xì)胞貼壁后，吸棄各組培養(yǎng)基，用相應(yīng)的培養(yǎng)基稀釋4倍的致敏血清刺激細(xì)胞24 h，使細(xì)胞處于致敏狀態(tài)，模型組用750 ng/mL的Anti-DNP-IgE致敏。24 h后用改良臺(tái)式液清洗兩遍，加入改良臺(tái)式液配置的不同濃度的藥物，模型組加入1 μg/mL的DNP-BSA 200 μL，正常組加入200 μL改良臺(tái)式液，裂解組加入200 μL濃度為1% 的TRItonx-100。在37℃，5% CO2條件下刺激1 h，取細(xì)胞上清。將細(xì)胞上清液和裂解液儲(chǔ)存在-20℃下以用于后期實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.6 甲苯胺藍(lán)染色

取對(duì)數(shù)生長期RBL-2H3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至每毫升1×105個(gè)，均勻鋪在含有細(xì)胞爬片的6孔板內(nèi)。待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基配置的750 ng/mL的Anti-DNP-IgE孵育模型組細(xì)胞，佐劑對(duì)照組及各給藥組分別加入培養(yǎng)基稀釋4倍的血清孵育。24 h后用1 mL改良臺(tái)式液洗滌兩遍以清除殘存培養(yǎng)基。后分別加入改良臺(tái)式液配置的含有相應(yīng)濃度藥物的溶液200 μL，對(duì)照組用相同量的改良臺(tái)式液替換，模型組加入200 μL DNP-BSA(1 μg/mL)，刺激1 h后，冰浴使反應(yīng)停止后，取出細(xì)胞爬片，立即置于95%乙醇中，細(xì)胞固定后取出細(xì)胞爬片滴入甲苯胺藍(lán)染色溶液進(jìn)行染色。在顯微鏡下觀察細(xì)胞脫顆粒形態(tài)并拍照。

1.3.7 β-氨基糖苷酶(β-HEX)釋放率的測(cè)定

在普通96孔板中，取50 μL各組別細(xì)胞上清，每組3個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μL酶底物，37℃恒溫孵育箱中孵育45 min，后加入終止液(NaHCO3/Na2CO3)200 μL中止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀(DIALAB GmbH，Vienna，Austria)在405 nm的波長下測(cè)量光密度(OD)。β-氨基糖苷酶釋放率(%)=(給藥組OD-空白對(duì)照組OD)/(裂解組OD-空白對(duì)照組OD)×100%。

1.3.8 組胺(His)釋放率測(cè)定

在全黑96孔板中，取100 μL各組別細(xì)胞上清，每組3個(gè)復(fù)孔，每孔加入20 μL NaOH溶液，20 μL組胺底物，37℃恒溫孵育箱中孵育15 min，加入終止液3% HCl溶液20 μL中止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀(DIALAB GmbH，Vienna，Austria)在Ex/Em=460/350 nm的波長下測(cè)量熒光強(qiáng)度。組胺釋放率(%)=(給藥組熒光強(qiáng)度-空白對(duì)照組熒光強(qiáng)度)/(裂解組熒光強(qiáng)度-空白對(duì)照組熒光強(qiáng)度)×100%。

1.3.9 Western blot

選取對(duì)數(shù)生長期的RBL-2H3，調(diào)整細(xì)胞密度至每毫升1×105個(gè)，均勻鋪在6孔板內(nèi)。待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基配置的750 ng/mL的Anti-DNP-IgE孵育模型組細(xì)胞，佐劑對(duì)照組及各給藥組分別加入培養(yǎng)基稀釋4倍的血清，正常組選擇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。孵育24 h后用1 mL改良臺(tái)式液洗滌兩遍以清除殘存培養(yǎng)基。模型組及各給藥組分別加入改良臺(tái)式液配置的1 μg/mL DNP-BSA及各濃度藥物200 μL，對(duì)照組加入200 μL改良臺(tái)式液。孵育1 h后用冷的PBS清洗細(xì)胞兩遍，用細(xì)胞刮刮下各組細(xì)胞放入不同的1.5 mL Ep管中，離心后棄上清加入100 μL細(xì)胞裂解液在冰浴中裂解30 min，12 000 r/min離心取上清。取少量含蛋白的裂解液稀釋10倍后使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白定量。應(yīng)用Western blot法檢測(cè)在Ⅰ型超敏反應(yīng)期間p-JNK，JNK，p-ERK，ERK，p-p38，p-38蛋白表達(dá)情況的改變。按照Kim描述的方法進(jìn)行操作，并重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次[8]。使用Image-Pro Plus分析軟件(Media Cybernetics, Inc., MD, USA)進(jìn)行進(jìn)一步的圖形分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 5-HMF和OMBF誘導(dǎo)的體內(nèi)I型超敏反應(yīng)

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清中IgE、IgG以及IL-4的變化(見圖1)。圖1A顯示5-HMF組和OMBF組的IgE含量與對(duì)照組相比均有顯著增長。佐劑組與生理鹽水對(duì)照組相比無明顯變化。圖1B顯示，IgG水平的改變主要體現(xiàn)在5-HMF高劑量組以及OMBF劑量組。在圖1C中，除佐劑組外，所有組均較生理鹽水對(duì)照組有明顯的增長。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明5-HMF及其二聚體OMBF在低、高劑量下均可誘導(dǎo)I型超敏反應(yīng)的發(fā)生。

2.2 5-HMF和OMBF誘導(dǎo)的體外 I 型超敏反應(yīng)

2.2.1 BN大鼠血清中IgE的測(cè)定結(jié)果

ELISA測(cè)定含藥血清中IgE的含量(見圖2)，結(jié)果顯示，除佐劑組，其余各組與生理鹽水組的IgE含量相比均顯著性增高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞的致敏刺激。

注： BN大鼠血清中IgE(A)、IgG(B)、IL-4(C)的含量測(cè)定；與NS組相比，*P<0.05。圖1 BN大鼠血清中I型超敏反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定Note. The determination of IgE (A), IgG (B), and IL-4 (C) in the serum of BN rats.Compared with the NS group,*P<0.05.Figure 1 The determination of related indexes of type I hypersensitivity in serum of BN rats

注：與NS組相比，*P<0.05。圖2 含藥血清中IgE含量測(cè)定Note. Compared with the NS group,*P<0.05.Figure 2 The determination of IgE in drug-containing serum

2.2.2 TB染色結(jié)果

甲苯胺藍(lán)(Toluidine Blue O)是一種常用的人工合成染料，可以與肥大細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)肝素、組織胺等物質(zhì)發(fā)生特異性染色[9]。

染色結(jié)果顯示，佐劑組RBL-2H3細(xì)胞呈長梭形，邊緣完整，結(jié)構(gòu)致密，未見脫顆粒。而脫顆粒的細(xì)胞體積增大，邊緣不整，出現(xiàn)大量的空泡或顆粒樣結(jié)構(gòu)。RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒形態(tài)觀察(見圖3)，模型組脫顆粒明顯，可見大部分細(xì)胞膜破裂，有顆粒樣物質(zhì)滲出。5-HMF及OMBF低劑量組部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持完整，仍可見大量脫顆粒細(xì)胞。5-HMF及OMBF高劑量組大部分細(xì)胞均出現(xiàn)了脫顆粒的現(xiàn)象，細(xì)胞邊緣不整，細(xì)胞密度減低，出現(xiàn)顆粒樣尾狀結(jié)構(gòu)。由上述結(jié)果可知，RBL-2H3細(xì)胞在OMBF高劑量作用下脫顆粒較為嚴(yán)重，即OMBF的免疫毒性高于單體5-HMF。

2.2.3 β-氨基糖苷酶釋放情況

β-氨基糖苷酶(β-HEX)被認(rèn)為是間接反映細(xì)胞脫顆粒情況的重要指標(biāo)[10-11]。通過測(cè)定細(xì)胞上清中β-HEX的含量，計(jì)算各給藥組釋放率來判斷各給藥組產(chǎn)生的免疫毒性的強(qiáng)弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(見圖4)，各給藥組除佐劑組外均出現(xiàn)了顯著性差異，且OMBF高劑量組誘導(dǎo)細(xì)胞上清中的β-HEX的釋放量高于5-HMF。

2.2.4 組胺的釋放情況

組胺(Histamine)在人體中分布廣泛，主要存在于肥大細(xì)胞以及嗜堿性細(xì)胞中，由組氨酸經(jīng)組氨酸脫羧酶(HDC)脫羧而產(chǎn)生,是反映細(xì)胞脫顆粒嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[10,12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(見圖5)，給藥組刺激RBL-2H3細(xì)胞，高劑量組和模型組出現(xiàn)了顯著性差異。提示較高劑量的5-HMF及其二聚體均能誘導(dǎo)細(xì)胞脫顆粒產(chǎn)生免疫毒性。

2.3 Western blot結(jié)果

蛋白免疫印跡法檢測(cè)用于研究在Ⅰ型超敏反應(yīng)期間p-JNK，JNK，p-ERK，ERK，p-p38，p38在RBL-2H3細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果以磷酸化蛋白和總蛋白的表達(dá)量比值呈現(xiàn)(見圖6)。與空白對(duì)照組相比，ERK，JNK和p38的磷酸化水平表達(dá)均上調(diào)。在5-HMF和OMBF的作用下，蛋白表達(dá)上調(diào)的水平未表現(xiàn)出明顯的劑量差異性，但從JNK和p38的磷酸化蛋白表達(dá)結(jié)果分析，OMBF比5-HMF更能促進(jìn)磷酸化蛋白的表達(dá)，表現(xiàn)出了更強(qiáng)的免疫毒性。

注：上行顯示的是RBL-2H3細(xì)胞的正常形態(tài)及佐劑和陽性藥作用后的細(xì)胞形態(tài)，下行顯示的是RBL-2H3細(xì)胞經(jīng)不同劑量的5-HMF及OMBF刺激后的細(xì)胞形態(tài)。圖3 RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒形態(tài)觀察Note. The upper line shows the normal morphology of RBL-2H3 cells and the morphology of the cells stimulated by adjuvant and positive drugs. The next line shows the morphology of RBL-2H3 cells stimulated by different doses of 5-HMF and OMBF.Figure 3 The observation of RBL-2H3 cells

注：與Blank組相比，*P<0.05。圖4 RBL-2H3細(xì)胞上清中β-HEX釋放率的測(cè)定Note. Compared with the Blank group,*P<0.05.Figure 4 Determination of β-HEX release rate in supernatant of RBL-2H3 cells

注：與Blank組相比，*P<0.05。圖5 RBL-2H3細(xì)胞上清液中His釋放率的測(cè)定Note. Compared with the Blank group,*P<0.05.Figure 5 Determination of His release rate in supernatant of RBL-2H3 cell

3 討論

先前的研究發(fā)現(xiàn)5-HMF具有抗氧化、抗組織缺氧等生理藥理作用[13-15]。然而，研究表明該物質(zhì)具有毒理學(xué)特性，5-HMF具有皮膚、粘膜和呼吸道刺激性[16]。此外，關(guān)于5-HMF的致突變性和致癌性尚且存在爭(zhēng)議[17-20]?；谏鲜鲈?，中國藥典和美國藥典將葡萄糖注射液在加熱和貯存過程中產(chǎn)生的5-HMF視為有害雜質(zhì)。同樣，在一定條件下，5-HMF會(huì)發(fā)生聚合生成其二聚體產(chǎn)物OMBF，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)部分中藥注射劑中同時(shí)含有5-HMF和OMBF[21]。然而，到目前為止，關(guān)于OMBF的潛在毒性的研究很少，值得確認(rèn)和探索可能的毒性與機(jī)制。

我們采用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，采用免疫系統(tǒng)發(fā)達(dá)的Brown Norway(BN)大鼠作為研究對(duì)象，通過測(cè)定給藥前后血清中IgG、IgE和炎性因子的含量變化探究藥物的免疫毒性。除了IgG之外，還可以更精準(zhǔn)的測(cè)定IgG1的含量，在今后的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中我們將加以考慮。體外實(shí)驗(yàn)采用大鼠嗜堿性粒細(xì)胞(RBL-2H3)系，RBL-2H3細(xì)胞表面Fc受體大量表達(dá)，是用于研究I型超敏反應(yīng)的常用細(xì)胞系。眾所周知，I型超敏反應(yīng)需要致敏和激發(fā)兩個(gè)階段，我們通過獲取大鼠含藥血清，孵育細(xì)胞24 h使細(xì)胞致敏，后加入相應(yīng)濃度藥物，模擬機(jī)體I型超敏反應(yīng)的全過程。通過甲苯胺藍(lán)染色觀察細(xì)胞脫顆粒形態(tài)，直接反映藥物免疫毒性的強(qiáng)弱。通過測(cè)定細(xì)胞上清中典型指標(biāo)β-氨基糖苷酶及組胺的釋放量，通過比較給藥組與空白對(duì)照組釋放率的差異來判斷藥物免疫毒性的強(qiáng)弱。MAPK信號(hào)通路的激活在I型超敏反應(yīng)中起重要作用，是抗過敏藥物的靶點(diǎn)，其特征在于活化后，磷酸化蛋白表達(dá)增多。MAPK信號(hào)通路與炎性介質(zhì)的釋放息息相關(guān)，而過敏反應(yīng)中IL-4等炎性介質(zhì)顯著升高。因此，本研究在免疫毒性評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，對(duì)5-HMF及其二聚體OMBF引起的MAPK通路中p-JNK，p-ERK和p-p38這三種蛋白表達(dá)量的變化進(jìn)行了研究，以此確定5-HMF及其二聚體OMBF產(chǎn)生免疫毒性可能的作用通路。

通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，本研究發(fā)現(xiàn)5-HMF和OMBF作為小分子過敏原均可誘導(dǎo)I型超敏反應(yīng)的發(fā)生。5-HMF及OMBF組內(nèi)低、高劑量之間并未表現(xiàn)出顯著的差異性，這可能與引發(fā)免疫反應(yīng)的物質(zhì)量效關(guān)系不明顯有關(guān)，在今后我們的相關(guān)研究中會(huì)對(duì)其進(jìn)一步觀察和驗(yàn)證。從甲苯胺藍(lán)染色的結(jié)果來看，OMBF誘導(dǎo)細(xì)胞脫顆粒的嚴(yán)重程度明顯高于5-HMF，表現(xiàn)出了更強(qiáng)的免疫毒性。從Western blot的結(jié)果也可以看出，OMBF誘導(dǎo)RBL-2H3細(xì)胞p-p38以及p-JNK的表達(dá)量高于5-HMF組的表達(dá)量，從蛋白表達(dá)上進(jìn)一步證實(shí)了5-HMF聚合生成OMBF后毒性增加，且二者產(chǎn)生的免疫毒性與MAPK家族蛋白磷酸化表達(dá)上調(diào)有關(guān)。結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果，表明5-HMF和OMBF可同時(shí)導(dǎo)致過敏反應(yīng)以及類過敏反應(yīng)的發(fā)生，且產(chǎn)生相似的癥狀[22]，于是我們提出了新的假設(shè)，認(rèn)為過敏反應(yīng)與類過敏反應(yīng)在作用通路上存在相同的地方，我們將會(huì)進(jìn)一步完善二者的機(jī)制通路，因此二者在機(jī)制上的區(qū)別和聯(lián)系將會(huì)成為下一步研究的重點(diǎn)。