韓文東，瞿 滌,2*

(1.上海復(fù)旦大學(xué)三級生物安全防護實驗室，上海 200032； 2.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)健委醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點實驗室，上海 200032)

布魯氏菌病(Brucellosis，簡稱布病)是嚴重影響人類健康的細菌性人畜共患傳染病[1]，世界范圍內(nèi)每年新發(fā)人感染布病病例超過50萬[2]。我國自2000年以來，布病感染范圍從北方畜牧地區(qū)迅速擴展至沿海及東南部地區(qū)[3]，且呈持續(xù)上升趨勢。實驗室獲得性布魯氏菌感染也常見報道[4]。人感染布病最常見的途徑是食入未經(jīng)消毒的牛奶、奶制品或直接接觸感染動物的分泌物、流產(chǎn)物等[5]，而人與之間的傳播則相對罕見。患者感染布魯氏菌后約90%病例出現(xiàn)急性發(fā)作的波狀熱，并伴隨頭疼、關(guān)節(jié)痛、盜汗、疲勞與厭食癥，易誤診為感冒癥狀。如不及時治療，病程可長達數(shù)年，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎、附睪-睪丸炎、神經(jīng)脊柱炎、肝脾膿腫以及心內(nèi)膜炎，嚴重者可能死亡。牧民、屠宰工人及醫(yī)院檢驗相關(guān)的醫(yī)護人員因職業(yè)因素，發(fā)病率高于普通人群[6]。此外，布魯氏菌還可通過氣溶膠途徑擴散傳播，成為生物武器和生物恐怖主義青睞的潛在工具[7]。

人感染布病的主要途徑是接觸感染動物[8]，對畜群進行疫苗接種被證實是控制人感染布病的有效策略，蒙古在WHO協(xié)助下連續(xù)進行了11年的羊群的疫苗接種，人類布病的發(fā)病率從1974年4.8/10萬下降到1981年的0.23/10萬[9]。雖然疫苗接種對控制布病流行具有重要作用，但目前布病疫苗存在保護時間短、血清學(xué)檢測無法區(qū)分免疫/感染以及毒力回復(fù)等問題[10]。布病研究雖然取得了不少階段性成果，但在許多國家布病仍然持續(xù)或再現(xiàn)[11]。因而，對布魯氏菌病原學(xué)、流行病學(xué)、疫苗學(xué)等各方面的研究尚有待進一步加強。

1 布魯氏菌生物種及感染宿主范圍

歷史資料顯示，布病起源于地中海地區(qū)[12]。羊布魯氏菌(Brucellamelitensis,B.melitensis)導(dǎo)致的布病又名馬耳他熱，其致病原首先由英國軍醫(yī)David Bruce于1887年分離出而命名為布魯氏菌(Brucella)。丹麥獸醫(yī)學(xué)家Bang[13]于1897年從患病牛體內(nèi)分離出可導(dǎo)致流產(chǎn)的牛布魯氏菌(B.abortus)。經(jīng)過一個多世紀的研究，布魯氏菌屬菌株不斷被發(fā)現(xiàn)。1914年Mohler等人[14]從感染豬的肝脾分離出豬布魯氏菌(B.suis)。1952年從新西蘭公羊附睪中分離出天然R型(Rough，粗糙型)綿羊附睪型布魯氏菌(B.ovis)[15]。1957年從美國西部地區(qū)野生沙林鼠中分離到沙林鼠布魯氏菌(B.neotomae)[16]。1966年從美國一家犬養(yǎng)殖場的流產(chǎn)胎犬組織中分離到犬布魯氏菌(B.canis)[17]。1994年至1998年間，從海洋生物中分離到B.pinnipidialis(海豚和鯨魚)和B.ceti(海豹)[18]。2007年從田鼠和紅狐分離到田鼠布魯氏菌B.microti[19]。2008年從奧地利紅狐分離出慢生長布魯氏菌B.vulpis[20]。2010年Scholz等人[21]從發(fā)生感染的乳房植入物分離到B.inopinata，其自然宿主尚不清楚，后來從蛙類標本中亦分離到同種菌株。2014年從狒狒的宮頸拭子中分離到B.papionis，但是否感染狒狒及對其他動物的致病性也尚無進一步研究[22]。

綜上，世界范圍內(nèi)目前發(fā)現(xiàn)的布魯氏菌基于細菌學(xué)、宿主偏好與致病性，結(jié)合分子分型與全基因組測序共確定了12個生物種，包括“經(jīng)典”的布魯氏菌6種，B.melitensis、B.abortus、B.suis、B.canis、B.ovis和B.neotomae；以及“新現(xiàn)”布魯氏菌6種，B.microti、B.pinnipidialis、B.ceti、B.inopinata、B.papionis和B.vulpis。

布魯氏菌對于宿主的偏好與其命名的生物種并非一一對應(yīng)，某一布魯氏菌在實驗研究或自然條件下可感染除其主要宿主的其他動物，如牛布魯氏菌的自然宿主是牛，但同時可感染羊群、野豬和駱駝(表1)。此外，“新現(xiàn)”布魯氏菌擴展了人類對其宿主種類與地理分布范圍的認識，不同布魯氏菌之間可能存在基因的水平轉(zhuǎn)移，這對布病的防控提出了更嚴峻的挑戰(zhàn)。

2 布魯氏菌胞內(nèi)存活機制

布魯氏菌是兼性細胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌，其致病性與細菌在胞內(nèi)的存活密切相關(guān)，在此過程中其細胞壁發(fā)揮了主要作用。布魯氏菌細胞壁主要由外膜和肽聚糖組成，其外膜包括脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)、外膜蛋白(脂蛋白、通道蛋白)和磷脂[23]。LPS由脂質(zhì)A、核心單糖(core oligosaccharide)與O-多糖(O-polysaccharide，O-PS)組成，是布魯氏菌主要的表面抗原，具有親水性[24-26]。S型(Smooth，光滑型)菌株有完整的脂多糖(S-LPS)結(jié)構(gòu)，而R型菌落則為不完整的LPS，缺乏O-多糖，主要通過基因組wbk基因簇中perosamine合成相關(guān)基因突變或缺失所致。布魯氏菌的LPS與大腸桿菌相比，具有低內(nèi)毒素活性、高度抵抗巨噬細胞降解以及介導(dǎo)細菌對宿主免疫應(yīng)答的保護，從而利于細菌在細胞內(nèi)存活和增殖，從而在動物體內(nèi)呈持續(xù)感染狀態(tài)(persistence)。而缺乏O-PS的R型菌株則無法在巨噬細胞及感染動物中長期存活[24]。布魯氏菌S-LPS的O-PS含有誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的主要抗原決定簇，而R型菌落的免疫原主要是核心單糖和外膜蛋白。研究結(jié)果顯示，針對O-PS的多克隆/單克隆抗體均可有效保護小鼠抵抗S型菌株的感染，而針對R-LPS表位設(shè)計的特異性單克隆抗體對小鼠抵抗S型菌株(B.abortus)感染的保護作用不大，但對抵抗天然R型菌株(B.ovis)的感染則具有很強的保護作用[25]。

表1 布魯氏菌及其自然感染宿主

注：*基因組信息：Gene Bank 參考基因組登錄號。

Note.*Genome, Gene Bank Ref Seq accession number.

布魯氏菌S型菌株感染主要依賴于宿主的細胞骨架進行內(nèi)化[26]。細菌O-PS與宿主細胞膜富含膽固醇的脂筏相互作用，促進與宿主細胞的接觸并介導(dǎo)其內(nèi)化入巨噬細胞[27]。脂筏含有鞘糖脂、膽固醇以及糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，從而促進膜相關(guān)事件的發(fā)生，如多亞基膜復(fù)合物的形成、跨膜信號傳導(dǎo)以及膜融合[28]，同時布魯氏菌具有防止補體介導(dǎo)的細菌裂解和宿主細胞凋亡的能力。巨噬細胞表面IgG和補體(C3b和4b)受體對布魯氏菌產(chǎn)生調(diào)理作用[29]，從而幫助與脂筏結(jié)合的細菌轉(zhuǎn)移并靶向進入吞噬溶酶體。R型菌株由于缺乏O-PS從而不能維持與脂筏的相互作用，更易被巨噬細胞表面的Toll樣受體4(TLR4)或甘露糖受體識別而促進了R型布魯氏菌的內(nèi)吞[30]。粗糙型菌株表現(xiàn)更高的侵襲性，可能是由于被O-PS保護的外膜蛋白暴露，從而增加了粘附巨噬細胞的能力。R型布魯氏菌雖然更有效率地被宿主巨噬細胞吞噬，并迅速定位到吞噬溶酶體中，通常卻無法復(fù)制，而被細胞內(nèi)吞后存活的S型菌株則能夠在細胞內(nèi)復(fù)制(圖1)。

通過脂筏進入宿主巨噬細胞的S型布魯氏菌快速通過早期內(nèi)體形成名為“布氏小體”的含有布魯氏菌液泡(brucella-containing vacuole, BCV)，繼而通過類似于自噬體生發(fā)的方式獲得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分形成修飾吞噬體。布魯氏菌最初定位于酸化的吞噬體內(nèi)，酸化環(huán)境定向誘導(dǎo)VirB操縱子(virB1-10)的表達，調(diào)控Ⅳ型分泌系統(tǒng)(type Ⅳ secretion system, T4SS)相關(guān)基因的表達[31]。VirB操縱子與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)交互，以中和吞噬體的pH值。布魯氏菌細胞內(nèi)存活的另一種機制涉及修飾吞噬體膜的脂質(zhì)含量，細菌通過表達和分泌環(huán)狀葡聚糖合酶(CGS)，可以破壞細菌周圍細胞內(nèi)膜內(nèi)的脂筏微結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，脂筏分布的改變抑制吞噬體成熟，防止與溶酶體融合，從而保證了細菌自身的存活，這種機制是獨立于virB操縱子而發(fā)揮作用[32]。

此外氧化殺傷是宿主吞噬細胞用于控制細胞內(nèi)病原體復(fù)制的主要機制，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)布魯氏菌具有多種對抗自由基的機制。布魯氏菌表達2種超氧化物歧化酶SODA和SODC來分解自由基的產(chǎn)生，其中SODC發(fā)揮抵抗巨噬細胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的超氧陰離子的作用[33]。布魯氏菌AHPC(烷基氫過氧化物還原酶C)還原過氧化物發(fā)揮阻止氧化殺傷功能，同時O-PS也具有抵抗宿主細胞陽離子肽和氧代謝物的作用[34-35]。綜上，布魯氏菌通過精確調(diào)節(jié)不同階段酶及分泌蛋白阻止被外界氧化殺傷從而移行至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及高爾基體進行復(fù)制。

3 布病疫苗的研究

動物疫苗接種是控制布病擴散與流行的有效措施。減毒活疫苗是目前被廣泛使用的，對布病(流產(chǎn)和/或感染的后代)的流行控制非常有效。20世紀60年代早期，B.abortusS19、B.melitensisRev1以及滅活的B.abortus45/20疫苗被廣泛使用[36]。美國在1996年批準使用B.abortusRB51[37]，我國使用的疫苗株為B.suisS2、B.melitensisM5，有效控制了我國布病的蔓延[38]，但減毒活疫苗存在保護時間短、導(dǎo)致懷孕母畜流產(chǎn)等毒力恢復(fù)的現(xiàn)象，另外目前血清學(xué)檢測手段尚不能區(qū)分疫苗接種與野菌株的感染[39]，這對疫苗的有效接種提出了挑戰(zhàn)。

迄今除我國批準皮上劃痕人用布魯氏菌104 M活疫苗外[40]，世界范圍內(nèi)無其他可用于人類預(yù)防布病的疫苗株，因此需要更加重視布病新型疫苗的研發(fā)。目前，不斷有新型候選疫苗提出，但其效力與安全性研究大多在小鼠模型進行驗證，缺乏疫苗對羊、牛、馬、豬大型動物及靈長類感染的保護驗證。此外，體內(nèi)抗原表達、佐劑和遞送方法的技術(shù)進步對于開發(fā)具有同等或更高保護效力的非活性布病疫苗提供了技術(shù)基礎(chǔ)。最近研究顯示，應(yīng)用流感、沙門菌、志賀菌等作為載體開發(fā)布病亞單位疫苗具有良好的前景(表2)。

4 布病疫苗效力評價的動物模型

布病研究常用的動物模型是近交系小鼠，特別是BALB/c和C57BL，是最常用作研究布病發(fā)病機理的實驗室模型，其他動物模型包括豚鼠、兔子、大鼠、非人靈長類及反芻動物如牛、羊[41]等。感染途徑以皮下注射為主，其他常見途徑包括腹腔注射、氣溶膠感染和滴鼻感染。感染動物脾腫大指數(shù)及脾內(nèi)細菌計數(shù)是常用的檢測指標。非人靈長類動物如獼猴等被證實可通過口服、皮下和氣溶膠途徑感染布魯氏菌[42]，感染后病理進程如菌血癥可長達8周，同時伴隨發(fā)展形成局灶性肉芽腫性肝炎，脾炎，淋巴結(jié)炎、睪丸-附睪炎以及子宮內(nèi)膜炎的病變，這些癥狀與人布病發(fā)展進程一致[43-44]，但由于實驗成本、倫理學(xué)等因素，限制了該模型的大規(guī)模使用，此外，羊、牛等反芻動物也存在同樣的問題。其他實驗動物如豚鼠，對布魯氏菌感染非常敏感，同樣被廣泛用于布魯氏菌的分離、抗生素治療的有效性評估以及布病疫苗效力的驗證[45]。豚鼠感染后，肝、脾、肺和淋巴結(jié)中均可觀察到炎性病變，且豚鼠模型表現(xiàn)出“發(fā)熱”癥狀，這是人布病發(fā)生后的典型癥狀(表3)。因此，基于實驗的可操作性與性價比，開展布病實驗研究應(yīng)優(yōu)先選擇豚鼠、小鼠模型。

表2 布病疫苗類型

表3 用于布病研究的實驗動物模型

5 主要問題與建議

綜上所述，目前布病研究中存在問題如下：1) “新現(xiàn)”的布魯氏菌生物種提示布魯氏菌是一株古老而又現(xiàn)代的菌株，菌株的進化伴隨著畜群的馴化、環(huán)境的變化以及畜牧業(yè)的擴展范圍而變化，但各生物種之間的基因組進化尚不清楚。2)布魯氏菌宿主分布廣泛，從陸地到海洋，從恒溫動物到變溫動物，同時細菌也伴隨野生動物的遷徙以及人類的活動而播散于全世界，生物種之間可能存在的基因水平轉(zhuǎn)移，從而對布病的防控帶來新的挑戰(zhàn)。3)實驗室布病研究常用動物模型為小鼠，細菌感染后其發(fā)病具有自限性，不能有效模擬人類感染的發(fā)病進程。雖然豚鼠感染表現(xiàn)優(yōu)于小鼠，但其規(guī)?；曫B(yǎng)及性價比都弱于小鼠模型，從而限制了布病的研究。4)布病疫苗研制難度大，新型疫苗包括亞單位疫苗、DNA疫苗、載體疫苗等的保護力無法達到減毒活疫苗水平，功能基因組研究的深入可能對該問題提供一定的幫助。

因此，針對以上問題應(yīng)該重點進行如下研究：1)對于布魯氏菌菌株的多樣性加強研究，尋找其與α-變形菌綱內(nèi)其他細菌如巴爾通體、根瘤菌在進化過程中存在的聯(lián)系，深入了解布魯氏菌屬細菌基因組的進化。2)加強對布魯氏菌致病機制的研究，深入挖掘致病基因的功能及其與宿主之間的相互作用。3)優(yōu)化布病動物模型，從而有效復(fù)制人類感染進程。4)進行人布病疫苗的開發(fā)以及持續(xù)的動物疫苗和人體疫苗的接種計劃，對于控制布病缺一不可。