管博文，盧延華，石桂英，蘇路路，王玉全，王 衛(wèi)，魏 強(qiáng)，白 琳，孟愛民

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室，北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術(shù)研究中心，北京 100021)

中國是世界上老年人口最多的國家，給當(dāng)今社會和經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來了巨大挑戰(zhàn)。在老齡化過程中機(jī)體穩(wěn)態(tài)平衡被打破，身體各系統(tǒng)機(jī)能不斷減退，成為各種老年病的重要危險因素，嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量。衰老有很多種理論，包括自由基損傷，端粒酶縮短，DNA損傷和免疫衰老等。其中免疫衰老學(xué)說的核心觀點(diǎn)是機(jī)體衰老是免疫衰老，神經(jīng)衰老，內(nèi)分泌紊亂共同導(dǎo)致的。機(jī)體的衰老導(dǎo)致免疫器官的萎縮，進(jìn)一步導(dǎo)致淋巴細(xì)胞功能的下降，對應(yīng)激的應(yīng)答減弱，反過來導(dǎo)致機(jī)體的進(jìn)一步衰老。神經(jīng)細(xì)胞和免疫細(xì)胞有相同的細(xì)胞因子受體，存在著相互作用，神經(jīng)系統(tǒng)的衰老也會導(dǎo)致內(nèi)分泌系統(tǒng)的紊亂，最終導(dǎo)致整個機(jī)體的衰老加快[1-3]。

相比低等動物，嚙齒類動物在身體結(jié)構(gòu)功能上和基因上都與人更加接近，其中大鼠在神經(jīng)，毒理和代謝上更接近人類，有利于未來制作基因修飾的早衰大鼠模型[4-5]。所以本文選用老年大鼠檢測外周血、脾免疫細(xì)胞分型及免疫細(xì)胞衰老指標(biāo)，并與對青年大鼠進(jìn)行比較分析。進(jìn)一步分析各項指標(biāo)的性別差異，為研究老齡化改變及老年病提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級青年SD大鼠，8周齡，共10只，雌雄各半，雄性體重265～285 g，雌性體重199～205 g；SPF級12月齡SD雄性大鼠10只，體重720～970 g，雌性大鼠10只，體重范圍360～490 g。SD大鼠均購于北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004]。青年與老年大鼠均飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所動物房屏障環(huán)境[SYXK(京)2015-0035]，溫度為20℃～26℃，內(nèi)外壓差大于10帕斯卡，相對濕度為40%～70%，12 h進(jìn)行一次晝夜交替，照明強(qiáng)度為15～20勒克斯，動物自由取食飲水。本實驗經(jīng)過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所IACUC的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為MAM17001。并依照實驗動物倫理和福利要求使用實驗動物。

1.2 主要試劑與儀器

流式抗體CD25-PE、CD3-FITC購于eBioscience；CD8 PE-Cy7、Mac-PE購于Thermofisher scientific；CD4-APC、CD161-FITC、CD45RA-APC、CD3-FITC、CD45RA-APC購于BioLegend；紅細(xì)胞裂解液購于Invitrogen公司；EasySepTMRat T Cell Isolation Kit購于STEMCELL Technologies；大鼠脾單個核細(xì)胞分離液試劑盒由索萊寶提供；外周血計數(shù)及分類由全自動血液分析儀PentraDX120(ABX)分析；血細(xì)胞免疫分型應(yīng)用BD流式分析儀(BD FACSAria II)檢測。

1.3 實驗方法

1.3.1 外周血細(xì)胞計數(shù)及分類

大鼠稱重腹腔注射2%戊巴比妥鈉，麻醉后腹主動脈取血，醫(yī)用抗凝采血管收集，用于外周血計數(shù)及白細(xì)胞分類。取血后安樂死[6]。

1.3.2 免疫臟器系數(shù)

大鼠安樂死后，取胸腺、脾和大腦分別稱重，計算胸腺系數(shù)和脾系數(shù)。胸腺系數(shù)=胸腺重量(g)/大鼠大腦重(g)，脾系數(shù)=脾重量(g)/大鼠大腦重(g)[7-8]。

1.3.3 外周血免疫細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞分型檢測

將大鼠脾研磨制備脾細(xì)胞懸液。取一定量脾懸液和外周血分別加入紅細(xì)胞裂解液室溫裂解8 min，加入PBS終止裂紅，并離心洗滌一次，離心條件為400 g，4℃，5 min。棄上清重懸加入對應(yīng)抗體4℃孵育。PBS洗滌并重懸，離心條件同上。用流式細(xì)胞儀分別進(jìn)行外周血和脾淋巴細(xì)胞的免疫分型檢測[9]。

1.3.4 脾T細(xì)胞分離及P16 mRNA表達(dá)量檢測

利用試劑盒采用密度梯度離心法分離大鼠脾單個核細(xì)胞、免疫磁珠法富集T細(xì)胞。具體步驟如下：取適量脾細(xì)胞懸液體積調(diào)節(jié)為3 mL，緩慢加到ficoll分離液上，室溫1500 r/min離心25 min。離心后取單個核細(xì)胞層，用不含鈣鎂Hank’s液洗滌2次。用含有2%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和1 mM EDTA的PBS重懸并計數(shù)，將濃度調(diào)節(jié)為每毫升5×107個。在樣品中按50 μL/mL加入Cocktail混合抗體，混勻，室溫孵育10 min。孵育結(jié)束后在樣品中按50 μL/mL加入磁珠(RapidSpheres),并加入含2% FBS和1mM EDTA的PBS補(bǔ)齊至5 mL。放入磁鐵分離器中孵育，室溫10 min。孵育后其他細(xì)胞被磁珠包被吸附在管壁，細(xì)胞懸液中為T細(xì)胞。收集細(xì)胞懸液，離心重懸計數(shù)，按每1×106～5×106個細(xì)胞加入1 mL TRIzol保存，由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司采用RT-qPCR檢測P16 mRNA表達(dá)量[10]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 外周血計數(shù)及分類

外周血計數(shù)結(jié)果顯示，與青年大鼠相比，老年大鼠白細(xì)胞計數(shù)降低(降低28.7%，P<0.05)，紅細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白含量升高(分別為P<0.01，P<0.05)。分類結(jié)果顯示淋巴細(xì)胞百分比下降(降低18.8%)；粒細(xì)胞百分比、嗜酸性粒細(xì)胞百分比和嗜堿性粒細(xì)胞百分比升高(分別升高40.2%、104.4%和28.9%，P<0.01、P<0.01和P<0.05)；血小板和單核細(xì)胞百分比未見差異。提示了老年大鼠淋系和粒系細(xì)胞分化偏移。結(jié)果如表1所示。

2.2 免疫臟器系數(shù)

由于老年大鼠與青年大鼠、兩組大鼠不同性別之間體重有明顯差異，常規(guī)的臟器系數(shù)(臟器/體重比)無法真實的反映臟器的變化，故免疫臟器系數(shù)以大鼠胸腺、脾重量與大腦重量比表示[8]。分析結(jié)果顯示，老年組與青年組大鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)未見顯著性差異。結(jié)果見圖1。

表1 老年大鼠與青年大鼠外周血計數(shù)比較

注：與青年大鼠相比，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with young rat，*P<0.05，**P<0.01.

2.3 外周血免疫分型

流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血輔助T細(xì)胞(CD4)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4 CD25)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD3 CD8)、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)和單核細(xì)胞，各種細(xì)胞分析門的設(shè)置見圖2。

流式結(jié)果顯示，與青年大鼠比較，老年組大鼠的輔助T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和單核細(xì)胞升高，B細(xì)胞降低，細(xì)胞毒性T細(xì)胞未見明顯差異。相較于青年組，老年組輔助T細(xì)胞從(32.34 ± 1.93)%上升到(39.67 ± 1.75)%(P<0.05)；老年組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞從(2.30 ± 0.42)%上升到(6.58 ± 0.93)%，(P<0.01)；老年組自然殺傷細(xì)胞從(3.02 ± 0.36)%上升到(6.21 ± 0.66)%(P<0.01)，老年組單核細(xì)胞從(0.43 ± 0.11)%上升到(1.00 ± 0.15)%(P<0.05)；相較于青年組，老年組B細(xì)胞從(39.14 ± 2.30)%下降到(31.50 ± 1.88)%(P<0.05)。細(xì)胞毒性T細(xì)胞未見明顯差異，見圖3。

2.4 脾免疫細(xì)胞分型

流式細(xì)胞術(shù)分析脾淋巴細(xì)胞CD3+和CD45RA+比例。見圖4。

結(jié)果顯示，與青年組相比，老年組CD3細(xì)胞比例未見明顯差異，CD45RA從(46.42 ± 3.65)%降低到(38.69 ± 5.52)%，差異有極顯著性(P<0.01)。結(jié)果見圖5。

2.5 脾T細(xì)胞P16 mRNA表達(dá)量檢測

為了檢測老年大鼠T淋巴細(xì)胞P16 mRNA表達(dá)量的改變，分離T細(xì)胞，RT-PCR檢測P16 mRNA表達(dá)量。結(jié)果顯示，相比于青年雄性大鼠，老年雄性大鼠P16 mRNA表達(dá)量明顯升高，從1.03±0.28上升到4.74±2.05(P<0.05)。結(jié)果見圖6。

圖1 老年大鼠與青年大鼠免疫臟器系數(shù)比較Figure 1 Comparison of organ coefficient between aged and young rat

圖2 外周血細(xì)胞流式分析門的設(shè)置及示意圖Figure 2 Representative gating strategy for peripheral blood immune cell phenotypes analyzed by flow cytometry

注：與青年大鼠相比，*P<0.05，**P<0.01。圖3 老年大鼠與青年大鼠外周血免疫細(xì)胞分型比較Note. Compared with young rat，*P<0.05，**P<0.01.Figure 3 Comparison of immune cell typing in peripheral bloodbetween aged and young rat

圖4 流式分析脾免疫細(xì)胞門的設(shè)置及示意圖Figure 4 Representative gating strategy for splenicimmune cell phenotypes analyzed by flow cytometry

注：與青年大鼠相比，**P<0.01。圖5 老年大鼠與青年大鼠脾免疫細(xì)胞分型比較Note. Compared with young rat，**P<0.01.Figure 5 Comparison of splenic immune cell typing between aged and youngrat

注：與青年雄性大鼠相比，**P<0.01。圖6 老年雄性大鼠和青年雄性大鼠脾T細(xì)胞的P16 mRNA表達(dá)比較Note. Compared with young male rat,**P<0.01.Figure 6 Comparison of P16 mRNA expression in splenic T cells between agemalerat and young male rat

3 討論

本研究對老年大鼠外周血計數(shù)、免疫細(xì)胞分型、臟器系數(shù)以及T細(xì)胞P16表達(dá)水平進(jìn)行檢測，并與青年大鼠進(jìn)行比較分析。

老年大鼠外周血檢測結(jié)果顯示白細(xì)胞減少，紅細(xì)胞升高；淋巴細(xì)胞比例減低，中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞比例升高，提示老年大鼠天然免疫功能下降，淋系與髓系比例發(fā)生改變出現(xiàn)，分化偏移，變態(tài)反應(yīng)性增強(qiáng)，與老年人出現(xiàn)的改變類似。與研究人員前期檢測老年小鼠的結(jié)果相同[9]。而在林洪燕和張海潔等[11-12]的研究中，老年人群外周血紅細(xì)胞和血紅蛋白都是趨于降低。胡雄飛等[13]的研究中，相較于青年大鼠，老年大鼠只有白細(xì)胞和血紅蛋白是升高的，其余各項均無顯著性差異。李長雷的研究中，則是紅細(xì)胞，中性粒細(xì)胞百分比，嗜堿性粒細(xì)胞百分比和單核細(xì)胞百分比上升，血小板，淋巴細(xì)胞百分比下降[14]。老年大鼠外周血的變化測定結(jié)果不一致，可能與測定實驗室條件不同有關(guān)，但老年大鼠外周血白細(xì)胞計數(shù)下降、淋巴細(xì)胞比例降低、中性粒細(xì)胞比例升高的結(jié)果比較一致。這可能與老年人易出現(xiàn)髓系白血病有關(guān)[15]。

外周血免疫分型中，老年組大鼠T細(xì)胞比例升高，B細(xì)胞比例明顯下降，CD4/CD8比例升高，調(diào)節(jié)T細(xì)胞顯著升高；B細(xì)胞下降與脾淋巴細(xì)胞分型檢測結(jié)果一致，提示老年大鼠在白細(xì)胞降低、淋巴細(xì)胞比例下降的基礎(chǔ)上，中樞淋巴器官和外周血B細(xì)胞水平降低，可能與老年人接種疫苗免疫反應(yīng)性下降，抗感染能力降低有關(guān)[16]。但這與課題組前期研究發(fā)現(xiàn)老年小鼠外周血僅有CD4比例降低不同[9]。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過主動調(diào)節(jié)的方式抑制存在于正常機(jī)體內(nèi)潛在的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化與增殖，防止自身免疫性疾病的發(fā)生；測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，老年大鼠調(diào)節(jié)T細(xì)胞比例升高，則可能與老年人出現(xiàn)免疫抑制，免疫監(jiān)視功能下降，腫瘤高發(fā)及轉(zhuǎn)移有關(guān)[17]。今后還要進(jìn)一步確認(rèn)這是否為老年SD大鼠的特有的T細(xì)胞表型改變。

檢測結(jié)果顯示老年組大鼠的NK細(xì)胞和單核細(xì)胞比例有明顯升高。這是在外周血白細(xì)胞比例下降的基礎(chǔ)上的升高，還需進(jìn)一步檢測NK細(xì)胞和單核細(xì)胞功能，探討這種改變的臨床意義。在于昉等[18]的研究中，老年人NK細(xì)胞的比例沒有明顯變化，但是在NK細(xì)胞毒活性明顯降低。鄧憲等[19]的研究中，老年人單核細(xì)胞數(shù)上升，與青年人群中單核細(xì)胞上升意義不同，在老年人群中可能代表機(jī)體衰老和凋亡細(xì)胞增多，單核細(xì)胞反應(yīng)性升高。

P16由p16INK4a基因編碼的細(xì)胞周期抑制劑，也是一種腫瘤抑制蛋白[20]。研究人員發(fā)現(xiàn)老年雄性大鼠脾T細(xì)胞P16 mRNA表達(dá)明顯高于青年雄性大鼠。老年小鼠中除了脾之外，在腦、心臟、肺和睪丸中也有明顯升高[21]。老年人T細(xì)胞p16INK4a的表達(dá)量隨年齡的增長呈指數(shù)增長[22]。在Melk等[23]的研究中顯示，人腎臟皮層按照年齡分為青年，成年和老年三組，P16的表達(dá)量與增齡成正相關(guān)。本文與兩個研究結(jié)果一致。同時也有文章報道，B淋巴細(xì)胞的衰老是由p16INK4a和Arf介導(dǎo)的[24]。在Krishnamurthy等[25]研究認(rèn)為Ink4a的表達(dá)可以作為一種衰老標(biāo)志物。在Wood等[26]的研究中用T細(xì)胞P16表達(dá)作為化療和干細(xì)胞移植患者的干細(xì)胞功能和治療效果的生物學(xué)檢測指標(biāo)。

本文對不同年齡段的大鼠進(jìn)行外周血和免疫細(xì)胞分型測定分析，并與老齡人群進(jìn)行比較醫(yī)學(xué)分析，驗證了老年大鼠衰老標(biāo)志物p16INK4a升高，初步表明增齡對大鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了巨大的影響，為研究免疫衰老及老年病提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。