黃樹(shù)武，王 靜，潘金春，陳梅玲，張 鈺，閔凡貴

(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510663)

多殺巴斯德桿菌(Pasteurellamultocida，P.multocida)是一種重要的人獸共患病原菌，其感染宿主十分廣泛，能感染多種家禽、家畜、野生動(dòng)物和人等，其中可引起兔鼻炎、肺炎、中耳炎和出血性敗血癥等疾病，導(dǎo)致兔急性或亞急性死亡，嚴(yán)重威脅兔的生命健康[1-2]。

細(xì)菌分型是了解細(xì)菌性傳染病流行特征的重要技術(shù)之一，對(duì)研究感染源、感染途徑以及地方性菌株和流行菌株之間的鑒別有著非常重要的作用[3]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，相較于生化分型、血清學(xué)分型、噬菌體分型等傳統(tǒng)分型技術(shù)，基因分型技術(shù)以其快速、簡(jiǎn)便、靈敏、靈活等特點(diǎn)日漸受到青睞。目前，臨床上用于多殺巴斯德桿菌診斷的基因分型方法主要包括基于莢膜編碼區(qū)的多重PCR方法和多位點(diǎn)序列分型法(multi-locus sequence typing, MLST)[4-5]。近年來(lái)，有意大利[6]、西班牙[7]和捷克共和國(guó)[8]等國(guó)家對(duì)兔源P.multocida進(jìn)行基因分型的報(bào)道，而我國(guó)僅有少量關(guān)于禽源、豬源等多殺巴斯德桿菌基因分型的研究[9-11]。

本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離的兔源P.multocida在生化表型特征的基礎(chǔ)上，運(yùn)用分子分型方法分析分離菌株的基因型特征和菌株間的同源性，揭示菌株間基因多態(tài)性和群體遺傳結(jié)構(gòu)，獲得廣東地區(qū)實(shí)驗(yàn)兔感染P.multocida分型數(shù)據(jù)，了解廣東地區(qū)實(shí)驗(yàn)兔感染P.multocida的流行特點(diǎn)，有利于更好地指導(dǎo)廣東本地實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制與監(jiān)測(cè)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)菌株來(lái)源于2000年至2018年期間廣東地區(qū)不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施，從普通級(jí)急性發(fā)病死亡的新西蘭兔呼吸道分離到的14株多殺巴斯德桿菌。實(shí)驗(yàn)操作在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用設(shè)施[SYXK(粵)2016-0122]進(jìn)行，所有操作遵循動(dòng)物福利和倫理要求，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。多殺巴斯德桿菌陽(yáng)性對(duì)照菌株(ATCC43137)來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑與儀器

血瓊脂平板(批號(hào)：ZBAp-180715D)和DHL平板(批號(hào)：H1038Y)購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；三糖鐵(批號(hào)：180828)、半固體瓊脂(批號(hào)：170817)和無(wú)菌生理鹽水(批號(hào)：H0993Y)購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；糖(苷或鹽)類等微量生化管購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；觸酶試劑盒(批號(hào)：1005440900)、氧化酶試劑盒(批號(hào)：19540501)、ID 32E(批號(hào)：1006416960)和API 20NE(批號(hào)：1006405070)生化試劑盒購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃股份有限公司；革蘭染色液試劑盒(批號(hào)：418082)購(gòu)自珠海貝索生物科技有限公司；PCR試劑包括細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(批號(hào)：R6717)、DNA純化回收試劑盒(批號(hào)：Q5601)購(gòu)自天根生化科技有限公司；Premix Taq(批號(hào)：A4701 A)、DL-2000 Marker(批號(hào)：A1801 A)、瓊脂糖(批號(hào)：172175)等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，各種試劑均在有限期內(nèi)使用。

生物安全柜(德國(guó)，Biometra型)；生化培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠，SPX-288型)；生物顯微鏡(德國(guó)，Leica DM500型)；ATB梅里埃鑒定儀(法國(guó)，ATB NEW型)；PCR超凈工作臺(tái)(上海市金鵬科技有限公司，BHC-1300II A/B3型)；PCR儀(德國(guó)，Biometra)；離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司，TG16-W型)；電泳儀(北京六一儀器廠，DYY-6C型)；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)，Bio-Rad PowerPac Basic 164-5050型)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分離培養(yǎng)與生化鑒定

依據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14926.5-2001實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多殺巴斯德桿菌檢測(cè)方法對(duì)臨床分離的可疑多殺巴斯德桿菌進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定分析。同時(shí)使用法國(guó)梅里埃生化鑒定條ID 32E和API 20 NE進(jìn)行生化鑒定，并按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行鑒定結(jié)果的判定。

1.3.2 分子分型分析

(1)菌株DNA提取

按照試劑盒說(shuō)明書，將所有臨床分離菌株使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行基因提取，提取的核酸作為分子分型的DNA模板。

(2)莢膜分型

按照Townsend等[12]建立的莢膜多重PCR方法對(duì)分離菌株進(jìn)行kmt基因定種鑒定，再使用莢膜特異基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD設(shè)計(jì)引物進(jìn)行A、B、D、E和F分型，分型引物序列(見(jiàn)表1)。反應(yīng)體系為2 μL基因組DNA加入2 μL引物(10 μmol/L), 25 μL Premix Ex Taq，加滅菌蒸餾水到反應(yīng)總體系為50 μL。反應(yīng)條件按95℃預(yù)變性12 min，95℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，反應(yīng)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。最后吸取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

(3)MLST分型

針對(duì)多殺巴斯德桿菌adk、aroA、deoD、gdhA、g6pd、mdh、pgi7個(gè)特異基因序列設(shè)計(jì)引物，分型引物序列及反應(yīng)條件(見(jiàn)表1)，對(duì)臨床分離菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，測(cè)序后經(jīng)過(guò)組裝分析確認(rèn)的序列提交MLST數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pubmlst.org/)進(jìn)行比對(duì)，得出每個(gè)菌株各位點(diǎn)的等位基因數(shù)目，然后進(jìn)行等位基因序列類型(sequence type, ST)鑒定，使用MLST數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析軟件進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析其遺傳進(jìn)化關(guān)系。

表1 多殺巴斯德桿菌株基因分型引物

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)與生化鑒定結(jié)果

所有分離菌株在血瓊脂平板上，于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后形成1 mm左右，光滑露滴樣或灰白色、不溶血的菌落。在DHL瓊脂平板上不生長(zhǎng)。革蘭氏染色為陰性小桿菌，兩端鈍圓并濃染。生化反應(yīng)為觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，氧化酶陽(yáng)性，三糖鐵試驗(yàn)為斜面及底層產(chǎn)酸不產(chǎn)氣、乙酸鉛紙條法顯示硫化氫陽(yáng)性，半固體動(dòng)力陰性，乳糖陽(yáng)性，尿素酶陰性，靛基質(zhì)試驗(yàn)陽(yáng)性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性，枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)陰性，賴氨酸脫羧酶為陰性，不液化明膠；而鳥氨酸脫羧酶結(jié)果為陽(yáng)性其菌株所占比例為79%(11/14)，葡萄糖陽(yáng)性比例為57%(8/14)，蔗糖陽(yáng)性比例為79%(11/14)，麥芽糖陽(yáng)性比例為14%(2/14)。

使用法國(guó)梅里埃生化鑒定條ID 32E和API 20 NE都能鑒定所有臨床分離菌株為多殺巴斯德桿菌，鑒定ID值都為99.3%以上，鑒定評(píng)價(jià)為好的鑒定。

2.2 分子分型結(jié)果

2.2.1 莢膜分型結(jié)果

將所有分離菌株進(jìn)行kmt基因定種鑒定，均出現(xiàn)約460 bp的目的條帶(見(jiàn)圖1A)。使用莢膜分型多重PCR方法擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)約1044 bp與760 bp兩種目的條帶(見(jiàn)圖1B)，據(jù)此將菌株分為A型與B型兩種莢膜血清型，A型為主，占比71.4%(10/14)。

2.2.2 MLST分型結(jié)果

將所有分離菌株經(jīng)7個(gè)管家基因的擴(kuò)增和測(cè)序，測(cè)序后序列提交MLST數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示有ST12、ST35型、ST72型、ST73型、ST76型、ST77型共6種ST型，并且首次發(fā)現(xiàn)了新ST76型，ST77型(見(jiàn)表2)。然后對(duì)分離菌株進(jìn)行聚類進(jìn)化分析，構(gòu)建廣東兔源多殺巴斯德菌株遺傳進(jìn)化樹(shù)與最小生成樹(shù)(見(jiàn)圖2)；并將本研究菌株與MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中多個(gè)國(guó)家兔源多殺巴斯德菌株進(jìn)行比對(duì)進(jìn)化分析，結(jié)果表明，本研究中兔源多殺巴斯德桿菌與意大利、西班牙、捷克共和國(guó)、丹麥等國(guó)家的菌株存在復(fù)雜的遺傳交叉進(jìn)化關(guān)系(見(jiàn)圖3)。

3 討論

據(jù)多個(gè)國(guó)家流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，多殺巴斯德桿菌感染是一種全球性的現(xiàn)象[6-8,11, 13-15]。鑒于多殺巴斯德桿菌感染宿主的多樣性與所致疾病的危害性，臨床上針對(duì)分離菌株開(kāi)展分型鑒定，對(duì)于了解其感染和致病規(guī)律，建立細(xì)菌流行病學(xué)資料具有重要的意義。

本研究在分離菌株培養(yǎng)特性與生理生化特性基礎(chǔ)上，應(yīng)用分子分型方法對(duì)其進(jìn)行分型研究。在菌株生化反應(yīng)特征上，臨床分離菌株大部分生化反應(yīng)相同，但個(gè)別生化反應(yīng)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)不一致。國(guó)內(nèi)亦有文獻(xiàn)報(bào)道多殺巴斯德的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和鳥氨酸脫羧酶等生化反應(yīng)結(jié)果陰陽(yáng)性不一[16-17]。倘若完全按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)，可能會(huì)導(dǎo)致誤判漏檢?？紤]通過(guò)PCR方法輔助診斷，或者借助商品化生化鑒定試劑盒方法驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性，作為一種有益補(bǔ)充手段。

注：A：kmt 基因定種鑒定, M: DL2000 DNA Marker; 1～14號(hào): 樣本; 15: 多殺巴斯德桿菌株(ATCC43137)陽(yáng)性對(duì)照; 16: 空白對(duì)照。B：莢膜分型多重PCR方法鑒定, M: DL2000 DNA Marker; 17～30: 樣本; 31: 多殺巴斯德桿菌株(ATCC43137)陽(yáng)性對(duì)照; 32: 空白對(duì)照。圖1 廣東地區(qū)兔源多殺巴斯德桿菌莢膜分型結(jié)果電泳圖Note. A: Identification of kmt gene species. M, DL2000 DNA Marker; 1～14, Sample; 15, Pasteurella multocida strain (ATCC43137) positive control; 16, Blank control. B: Capsule typing multiplex PCR method was identified. M, DL2000 DNA Marker; 17～30, Sample; 31, Pasteurella multocida strain (ATCC43137) positive control; 32, Blank control.Figure 1 Electrogram of capsule typing of Pasteurella multocida from rabbits in Guangdong

注：“+”表示陽(yáng)性。

Note. “+”: positive.

注：A：進(jìn)化樹(shù)圓圈從外到內(nèi)為菌株編號(hào)，分離時(shí)間，ST型，莢膜型；B：圓圈內(nèi)數(shù)字代表ST型。圖2 廣東地區(qū)兔源多殺巴斯德桿菌遺傳進(jìn)化關(guān)系與最小生成樹(shù)Note. A, The sequence of evolutionary tree circle is strain numbers, isolation time, MLST genotypes, Capsular genotypes from outside to inside. B, The number in the circle represents the MLST genotypes.Figure 2 Genetic evolution relationship and minimal spanning tree of pasteurella multocida isolates from rabbits in Guangdong

圖3 廣東地區(qū)兔源多殺巴斯德桿菌與多個(gè)國(guó)家菌株遺傳進(jìn)化分析Figure 3 Genetic and evolutionary relationship between Pasteurella multocida isolated from rabbit and strains from several countries in Guangdong

多殺巴斯德桿菌根據(jù)莢膜抗原可分為5種血清型，分別為A、B、D、E和F，不同血清型與其宿主和疾病之間有一定相關(guān)性，血清A和F與呼吸道疾病和家禽霍亂有關(guān)，血清B和E與出血性敗血癥有關(guān)，而D血清通常與豬萎縮性鼻炎相關(guān)[1,11,18]。目前已報(bào)道兔源P.multocida有A、D和F型三種莢膜血清型[6-8,11]。本研究中莢膜分型結(jié)果顯示廣東地區(qū)兔源P.multocida主要為A型，也發(fā)現(xiàn)兔源P.multocida莢膜血清B型。這與我國(guó)不同地區(qū)雞，鴨，豬等來(lái)源的P.multocida其莢膜優(yōu)勢(shì)血清型為A型一致[9-11,17]。病原菌株分離至兔呼吸道，通過(guò)呼吸道傳播感染，從而導(dǎo)致兔急性或亞急性死亡，應(yīng)引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)者與使用者的關(guān)注。

本研究將菌株MLST分型結(jié)果顯示，廣東地區(qū)兔源多殺巴斯德桿菌存在ST12、ST35、ST72、ST73、ST76、ST77共6種ST型，并且首次發(fā)現(xiàn)了新ST76(Adk8-aroA4-deoD5-gdhA3-g6pd5-Mdh7-Pgi5)型和ST77(Adk18-aroA21-deoD20-gdhA18-g6pd19-Mdh18-Pgi18)型，已提交MLST數(shù)據(jù)庫(kù)確認(rèn)并收錄。此研究揭示了廣東地區(qū)兔源多殺巴斯德桿菌菌株間的基因多態(tài)性，且動(dòng)物設(shè)施A，D，E的兔子都存在ST73型的菌株污染，構(gòu)成一個(gè)遺傳群體結(jié)構(gòu)，其他的ST型菌株感染存在散播性。另外，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施F從2016年分離到ST12型菌株，2018年6月份再次分離到同種基因型菌株，后8月份分離到ST77型菌株，考慮此時(shí)有外來(lái)變異菌株污染設(shè)施。通過(guò)對(duì)廣東地區(qū)菌株的進(jìn)化分析，ST12型菌株與ST35型、ST73型、ST76型和ST77型存在一定的進(jìn)化同源關(guān)系，而與ST72型菌株親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，尤其新發(fā)現(xiàn)的ST76型和ST77型可由ST12型菌株各進(jìn)化出一個(gè)分支而來(lái)。本研究將分型結(jié)果與MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中不同時(shí)間地理區(qū)域分離菌株進(jìn)行橫向與縱向比對(duì)分析。不同基因型的菌株流行存在地理區(qū)域性和偏向性，意大利以ST9、ST50和ST74為主，西班牙為ST50，捷克共和國(guó)為ST9，而本研究的兔源P.multocida以ST12和ST73為主；同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)本研究菌株與意大利、西班牙、捷克共和國(guó)等國(guó)家的菌株存在復(fù)雜的遺傳交叉進(jìn)化關(guān)系。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中普通級(jí)兔不要求排除多殺巴斯德桿菌，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)機(jī)構(gòu)放松了對(duì)該菌的控制，課題組曾對(duì)廣東地區(qū)普通級(jí)兔感染多殺巴斯德桿菌的攜帶情況進(jìn)行調(diào)查，顯示陽(yáng)性率為2.5%(4/160)(數(shù)據(jù)暫未發(fā)表)，鑒于多殺巴斯德桿菌對(duì)兔的危害性，且菌株主要通過(guò)呼吸道途徑傳播感染，在實(shí)驗(yàn)兔的生產(chǎn)繁育過(guò)程中需要高度重視。