王 蓉，王 永，駱永偉，許 麗，周 莉，孫祖越

(上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所藥理毒理學(xué)研究室，中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理學(xué)檢測中心，國家人口和計(jì)劃生育委員會計(jì)劃生育藥具重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，復(fù)旦大學(xué)生殖與發(fā)育研究院，上海 200032)

2012年，參考人用藥品國際協(xié)調(diào)組織及美國食品藥品監(jiān)督管理總局等指南[1-4]，原國家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品審評中心頒布了我國的《藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》。依據(jù)該指導(dǎo)原則，I段生殖毒性試驗(yàn)由交配前到交配期直至胚胎著床給藥，而Ⅱ段生殖毒性試驗(yàn)自胚胎著床至硬腭旨閉合給藥，主要目的在于評價受試物對生殖細(xì)胞、受孕和妊娠等親代生殖機(jī)能是否產(chǎn)生不良影響，是新藥非臨床安全性評價中判定外源性因素生殖毒性的標(biāo)準(zhǔn)方法[1-5]。

考慮到生殖毒性實(shí)驗(yàn)主要有以下幾個特點(diǎn)：1、SD大鼠交配、接受受試物時間以及分娩時間不同步；2、毒性表現(xiàn)的形式具有蓄積性、遷延性、滯后性和整體性；3、檢測指標(biāo)及其統(tǒng)計(jì)處理呈現(xiàn)多樣性和復(fù)雜性；4、窩效應(yīng)和窩大小不均一等。因此，數(shù)據(jù)采集、處理、解釋和分析具有一定的復(fù)雜性和難點(diǎn)。而陽性對照的設(shè)立可以屏蔽干擾因素，平衡非實(shí)驗(yàn)因素對于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，以利于充分觀察毒性效應(yīng)。為了對每一次實(shí)驗(yàn)都能做到認(rèn)真和謹(jǐn)慎，我們認(rèn)為建立一個良好的陽性模型對大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析以及對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋才會充分、真實(shí)和可信，是保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的重要環(huán)節(jié)[6-7]。

環(huán)磷酰胺對動物胎仔的致畸性已得到廣泛接受，常被設(shè)定為Ⅱ段生殖毒性實(shí)驗(yàn)的陽性對照受試物。同時，可作為Ⅱ段生殖毒性實(shí)驗(yàn)陽性對照的還有敵枯雙、阿斯匹林、維生素A和反應(yīng)停等，本研究室也對此進(jìn)行了系統(tǒng)研究[8]，而鮮有人進(jìn)行I段生殖毒性實(shí)驗(yàn)陽性對照物敏感性高低的對比研究?，F(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道顯示，CTX的I段生殖毒性研究集中于其對雄性大鼠精子及睪丸生精細(xì)胞等毒性[9]，少見對雌性動物毒性的報(bào)道。因此，本研究在GLP實(shí)驗(yàn)室條件下，比較雌性SD大鼠于交配前給予不同劑量和頻次的CTX后生殖和發(fā)育指標(biāo)的變化，發(fā)現(xiàn)生育力與早期胚胎發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)(Ⅰ段)標(biāo)準(zhǔn)化陽性對照模型的建立方案。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級SD大鼠150只，雌雄各半，雌鼠體重170～190 g，6～8周齡；雄鼠體重380～400 g，12～14周齡(均為接收時體重)，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供 [SCXK(滬)2018-0006]，合格證序號0034062。動物飼養(yǎng)于上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所(中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心)SPF級動物房內(nèi)[SYXK(滬)2018-0017]，室溫20℃～26℃，濕度40%～70%，12 h/12 h光照/黑暗，換氣每小時12次，全新風(fēng)，自由飲水?dāng)z食。本試驗(yàn)所涉及的動物管理、使用和相關(guān)操作均經(jīng)過中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心實(shí)驗(yàn)動物管理和使用委員會(IACUC)批準(zhǔn)并嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷，批準(zhǔn)號為(IACUC-20150315-01)。

1.2 主要試劑與儀器

BH-2生物顯微鏡，Olympus公司；PL1501-S電子天平，梅特勒-托利多公司；Zenith 200st酶標(biāo)儀，Anthos公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理

SD大鼠根據(jù)體重隨機(jī)分為3組，分別為溶媒對照組、CTX 20 mg/kg和CTX 100 mg/kg組，每組50只，雌雄各半。

溶媒對照組雌性大鼠交配前連續(xù)腹腔注射給予生理鹽水14 d至GD7停藥；CTX 100 mg/kg組雌性大鼠于交配前14 d一次性腹腔注射給予100 mg/kg的CTX；CTX 20 mg/kg組雌性大鼠于交配前14 d腹腔注射給予20 mg/kg的CTX，每日1次連續(xù)5 d。給藥體積均為10 mL/kg。

1.3.2 體重和攝食量測定

每天觀察1～2次SD大鼠外觀體征、行為活動及死亡等情況，發(fā)現(xiàn)死亡或?yàn)l死動物，及時剖檢。每周測定2次體重，每周測定1次攝食量(交配期除外)。

1.3.3 性周期和激素測檢測

式中：Pploss為場景k下的有功損耗；Ri為支路i的電阻；λ為懲罰因子；Pi、Qi分別為支路i的有功、無功功率；Vlim取值滿足當(dāng)Vi Vimax時，Vlim=Vimax。

各組雌性大鼠按1∶1比例與正常雄性大鼠合籠交配，連續(xù)交配2周，每天上午8∶00～9∶30進(jìn)行陰道涂片檢查，查到精子或陰栓時定為GD0，觀察其性周期(動情間期、動情前期、動情期和動情后期[10])及是否含有精子，計(jì)算SD大鼠交配成功的平均合籠時間和交配率；妊娠SD大鼠于GD14處死，2周內(nèi)仍未交配成功的雌性大鼠于交配結(jié)束后24 h處死，處死前采集外周血約2 mL，分離血清，ELISA法測定睪酮(testosterone, T)、雌二醇(estradiol, E2)、卵泡刺激素(follicule-stimulating hormone, FSH)、黃體生成素(luteinizing hormone, LH)和孕酮(progesterone, P)含量。

1.3.4 妊娠終末檢查

孕鼠于GD14處死后記錄黃體數(shù)、著床數(shù)、子宮連胎重、活胎數(shù)、死胎數(shù)、吸收胎數(shù)，檢查卵巢、子宮以及胎盤、胎鼠外觀，肉眼觀察有異常時進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。計(jì)算交配率、妊娠率、著床前丟失率(1-著床數(shù)/黃體數(shù))、著床后丟失率(1-活胎數(shù)/黃體數(shù))、平均著床率、活胎率、死胎率和吸收胎率。2周內(nèi)未交配成功雌鼠，除不檢查胎鼠、胎盤外，其它解剖后處理方法同交配成功雌鼠。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般狀況及體重

給藥后第5天開始，環(huán)磷酰胺組部分雌性SD大鼠均出現(xiàn)眼角、鼻周分泌物增多現(xiàn)象，至給藥后第7天，全部SD大鼠出現(xiàn)該異常，均持續(xù)3 d左右基本恢復(fù)，CTX 100 mg/kg組2只大鼠伴嘴角潰爛現(xiàn)象，給藥后第10天時其中1只死亡，另一只于給藥后3周基本恢復(fù)。溶媒對照組雌性SD大鼠外觀體征、行為活動均未見明顯異常，未出現(xiàn)SD大鼠死亡。

溶媒對照組和CTX 20 mg/kg動物交配前體重均呈逐漸升高趨勢，20 mg/kg組呈升-降-升趨勢，其中第8天和第11天時與溶媒對照組相比降低(P<0.01和P<0.05)，詳見表1。

如表2所示，妊娠期間，溶媒對照組、CTX 20 mg/kg和100 mg/kg組增重均呈U型變化趨勢，提示環(huán)磷酰胺造成的體重降低可恢復(fù)；GD0～GD3至GD10～GD14時，CTX 20 mg/kg和100 mg/kg組與溶媒對照組相比無明顯差異(P>0.05)。

2.2 攝食量

交配前第1周，CTX 20 mg/kg和100 mg/kg組雌性SD大鼠攝食量均明顯低于溶媒對照組(P<0.01)；妊娠期第2周，CTX 20 mg/kg組攝食量與溶媒對照組相比降低(P<0.01)，詳見表3。

2.3 性周期

交配期間，溶媒對照組、CTX 20 mg/kg和100 mg/kg組交配成功及未交配成功雌性SD大鼠均未見明顯性周期異常。上述各組交配成功的平均合籠時間分別為3.83、3.09和3.00 d，與溶媒對照組相比均未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.4 激素水平

如表4所示，與溶媒對照組相比，僅CTX 20 mg/kg組T顯著降低(P<0.01)，其它指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示20 mg/kg的CTX給藥方案可能會影響孕鼠卵泡內(nèi)膜細(xì)胞和腎上腺皮質(zhì)網(wǎng)狀帶細(xì)胞睪酮的產(chǎn)生。

2.5 妊娠結(jié)局

如表5所示，與溶媒對照組相比，僅CTX 100 mg/kg組著床后丟失率明顯升高(P<0.01)，與CTX處理組妊娠率、著床前丟失率、著床率、平均黃體數(shù)和平均著床數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示CTX 100 mg/kg的給藥方案僅影響妊娠母鼠著床后參數(shù)，不會影響著床前相關(guān)參數(shù)。

CTX 20 mg/kg組子宮連胎重和CTX 100 mg/kg組的平均活胎數(shù)、活胎率、吸收胎率與溶媒對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)，表明CTX 兩種給藥方案均可導(dǎo)致母體黃體功能不足進(jìn)而無法維持妊娠后子宮內(nèi)膜的正常生理作用，引起著床后相關(guān)指標(biāo)的異常。

表1 環(huán)磷酰胺對交配前SD雌鼠體重的影響

注：與溶媒對照組相比，*P<0.05,**P<0.01。aCTX 100 mg/kg D11時n=24。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.aCTX 100 mg/kg group withn=24 (D11).

表2 環(huán)磷酰胺對SD孕鼠體重的影響

表3 環(huán)磷酰胺對SD雌鼠攝食量的影響

注：與溶媒對照組相比，**P<0.01。

Note. Compared with the control group,**P< 0.01.

表4 環(huán)磷酰胺對SD孕鼠激素的影響

注：與溶媒對照組相比，**P<0.01。

Note. Compared with the control group,**P< 0.01.

表5 環(huán)磷酰胺對SD雌鼠妊娠結(jié)局的影響

注：與溶媒對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the control group,*P<0.05,**P< 0.01.

3 討論

CTX作為一種常見的烷化劑類免疫抑制劑，可以引發(fā)SD大鼠體重下降、攝食減低、骨髓抑制、感染甚至死亡等諸多全身毒性癥狀，但除死亡外其他癥狀停藥一定時間后均具有可恢復(fù)性[11]。本研究表明，雌性大鼠以2種不同的給藥方案(CTX 100 mg/kg，腹腔注射給藥1次和20 mg/kg，腹腔注射給藥5次)給予CTX后，體重和攝食降低；并出現(xiàn)明顯的眼角、鼻周分泌物增多，偶見皮膚潰爛和死亡，考慮與CTX所致的全身毒性及其恢復(fù)性相關(guān)。

CTX 20 mg/kg組睪酮顯著低于溶媒對照組，孕酮高于溶媒對照組。據(jù)Jarrell等報(bào)道[12]，CTX對卵巢具有潛在的毒性作用，對大鼠的急性影響表現(xiàn)為血清雌二醇和孕酮水平降低。結(jié)合本研究中SD大鼠激素的變化，認(rèn)為該給藥方案可輕度影響雌性大鼠卵巢分泌功能，與文獻(xiàn)報(bào)道具有較好一致性。

CTX 20 mg/kg和100 mg/kg組總黃體數(shù)、平均黃體數(shù)、總著床數(shù)和平均著床數(shù)雖與溶媒對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但均呈減少趨勢。據(jù)朱長林等報(bào)道[13]，CTX可使早期胚胎細(xì)胞數(shù)減少并可影響早期胚胎發(fā)育的毒性閾值，但若達(dá)到一定閾值，則導(dǎo)致桑椹胚無法生存，呈蛻變狀。因此，本研究采用的兩種給藥方案均可抑制雌性大鼠卵巢排卵數(shù)目，進(jìn)而減少其著床數(shù)，與文獻(xiàn)報(bào)道具有一致性。另外，兩種給藥方案均可導(dǎo)致吸收胎率和著床后丟失率明顯升高，活胎率和子宮連胎重明顯降低，表明CTX兩種給藥方案均可嚴(yán)重影響早期胚胎發(fā)育，延緩其生長速度或直接導(dǎo)致其死亡。

綜上，在GLP實(shí)驗(yàn)室條件下，SPF級雌性大鼠于交配前14 d按20 mg/kg和100 mg/kg分別腹腔注射給予CTX 5 d和1 d，每天1次，均可以成功地建立SD雌性大鼠生育力與早期胚胎發(fā)育毒性陽性模型。比較兩種給藥方案引發(fā)的雌性大鼠妊娠結(jié)局發(fā)現(xiàn)其中100 mg/kg 腹腔注射給予1次的給藥方案可以導(dǎo)致更多的陽性指標(biāo)變化(著床后丟失率明顯升高，活胎率和子宮連胎重明顯降低)和更明顯的陽性特征，可以作為雌性大鼠生育力與早期胚胎發(fā)育毒性陽性模型的標(biāo)準(zhǔn)化構(gòu)建方案。

目前，有文獻(xiàn)報(bào)道CTX作為烷化劑誘導(dǎo)卵巢功能發(fā)生異常[14]，少數(shù)實(shí)驗(yàn)室甚至對其進(jìn)行了比較全面的雌性生殖功能評價研究[15]，雖然彼此間所用的動物品系、給藥途徑、給藥階段、給藥劑量甚至實(shí)驗(yàn)室條件有所不同，得到的陽性指標(biāo)也不盡相同，但這些陽性結(jié)果和本研究得到的相關(guān)結(jié)果均表明了CTX對I段生殖毒性生殖和發(fā)育指標(biāo)影響的可能。鑒于本研究中仍有一些諸如性周期、激素等指標(biāo)沒有得到很明顯的陽性結(jié)果，因此CTX的給藥途徑、給藥階段和給藥劑量等仍有進(jìn)一步優(yōu)化的可能，各實(shí)驗(yàn)室間特別是GLP實(shí)驗(yàn)室間的比對研究也顯得尤為迫切，CTX成為公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)化陽性對照受試物，仍然需要進(jìn)一步的探索研究。