龐榮清，朱 慧,2，鄢東海,3，王 強，李自安，王金祥，于倩倩，阮光萍，朱向情，潘興華*

(1.聯(lián)勤保障部隊第九二〇醫(yī)院細胞生物治療中心，干細胞與免疫細胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，云南省細胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室，云南省干細胞工程實驗室，昆明 650032；2.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716000； 3.巴東縣人民醫(yī)院，湖北 巴東 444300)

由于取材方便、適于規(guī)模化生產(chǎn)、細胞增殖活性強等優(yōu)點，臍帶間充質(zhì)干細胞已經(jīng)成為再生醫(yī)學(xué)研究最為廣泛的種子細胞之一，是一種具有良好發(fā)展前景的細胞藥物[1]。干細胞具有傳統(tǒng)藥物所不具備的增殖能力、靶向遷移能力、自分泌能力等生物學(xué)特性，是現(xiàn)代藥代動力學(xué)研究的巨大挑戰(zhàn)。顯然傳統(tǒng)藥物的藥代動力學(xué)評估藥物吸收、分布、代謝的體系并不適于細胞藥物的評估，監(jiān)測干細胞在體內(nèi)的分布和清除才是關(guān)鍵[2]。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標(biāo)記是穩(wěn)定的體內(nèi)示蹤方法[3]，結(jié)合活體成像技術(shù)是監(jiān)測細胞在體內(nèi)分布的有效手段[4]。

杜氏肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne Muscular Dystrophy, DMD)是一種以骨骼肌、膈肌進行性變性、壞死為主要病理特征的遺傳性肌病，在出生男嬰中的檢出率約為1/3500。由于其家族遺傳性的特點，目前尚無有效治療方法。間充質(zhì)干細胞具有一定的再生和修復(fù)肌肉的作用，是肌營養(yǎng)不良癥的潛在治療藥物[5]。本實驗室的前期研究已成功分離、擴增和純化小鼠臍帶間充質(zhì)干細胞(mouse umbilical cord mesenchymal stem cell, mUCMSC)[6]，還從英國引入DMD治療研究最常用的X-連鎖肌萎縮(X-linked muscular dystrophy，mdx)小鼠，采用GFP示蹤結(jié)合活體成像技術(shù)，觀察臍帶間充質(zhì)干細胞進入mdx小鼠腹腔后的清除速率和組織靶向性,為臍帶間充質(zhì)干細胞用于肌病治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

經(jīng)鑒定5只清潔級mdx小鼠，雌性3只，雄性2只，體重22～26 g，確定性別后隨機分為實驗組(1♂2♀)和對照組(1♂1♀),48周齡(這個年齡已出現(xiàn)明顯腓腸肌、膈肌損傷)，由英國牛津大學(xué)Davies教授惠贈(動物入境檢疫許可證號為AD44010011)，飼養(yǎng)于原成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院實驗動物中心屏障系統(tǒng)環(huán)境實驗室[SYXK(滇)2015-0011]。經(jīng)過原成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)開展動物實驗研究(審批號：2016011號)。實驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》、按照3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

C57小鼠臍帶間充質(zhì)干細胞(mUCMSC)來自于作者所在云南省干細胞工程實驗室細胞庫，即復(fù)蘇經(jīng)免疫表型鑒定和誘導(dǎo)分化實驗鑒定合格的第三代mUCMSC用于實驗研究。Lenti慢病毒載體液為上海吉滿生物科技有限公司產(chǎn)品；培養(yǎng)基DMEM/F12、胎牛血清、0.25%EDTA-胰蛋白酶為Hyclone公司產(chǎn)品；80i熒光顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品。小動物活體成像儀FluorVivo，為環(huán)亞生物科技公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 mUCMSC的GFP轉(zhuǎn)染標(biāo)記

按照前期建立的mUCMSC培養(yǎng)方法[6]，將鑒定合格凍存的第三代mUCMSC快速解凍，移至50 mL離心管內(nèi)加入生理鹽水充分混勻后離心，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸后轉(zhuǎn)移至多個175 cm2培養(yǎng)瓶中靜置培養(yǎng)24 h，按照感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)MOI值為150的劑量加入慢病毒載體共培養(yǎng)72 h，在熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。消化收集慢病毒載體共培養(yǎng)72 h的mUCMSC，加入生理鹽水制成細胞濃度為每毫升1.25×107個的細胞懸液備用。

1.3.2 腹腔注射及活體成像觀察

實驗組3只mdx小鼠，仰臥位固定，酒精消毒腹壁后將其微微提起，小心穿刺，確保注射器針尖進入腹腔空隙但不進入腸管或其它臟器，每只腹腔一次性注射0.4 mL 生理鹽水細胞懸液(含5×106個GFP標(biāo)記的第三代mUCMSC)，對照組2只mdx小鼠對照僅注射0.4 mL 生理鹽水。在移植后1 h、3 h、5 h、24 h、1周用小動物活體成像儀觀察小鼠腹壁注射細胞局部和腹腔熒光信號的分布，并確定臍帶間充質(zhì)干細胞的清除速率。

1.3.3 膈肌組織學(xué)鏡檢觀察

參照前期建立的方法[7]，活體成像觀察結(jié)束立即處死實驗小鼠切取膈肌，采集每只鼠膈肌的左、中、右3小塊，分別置于固定架上滴加包埋劑，固化后每小塊膈肌制作冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察拍照，計數(shù)10倍鏡下每個視野內(nèi)熒光信號點，每小塊膈肌計數(shù)5個視野，每只鼠左、中、右3小塊膈肌共計數(shù)15個視野。比較分析實驗組和對照組之間熒光信號點數(shù)的差異。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 GFP轉(zhuǎn)染標(biāo)記的mUCMSC

按照最佳MOI值150的劑量加入慢病毒載體與mUCMSC共培養(yǎng)72 h后，熒光顯微鏡下觀察，可見大量貼壁生長細胞呈現(xiàn)明亮的綠色熒光(圖1A)。這些散發(fā)綠色熒光的mUCMSC，用0.25% trypsin-EDTA消化傳代3代，熒光亮度無明顯衰減(圖1B)。

注：A:GFP標(biāo)記的mUCMSC；B:傳代的GFP標(biāo)記的mUCMSC。圖1 慢病毒載體轉(zhuǎn)染標(biāo)記的mUCMSCNote. A, mUCMSC-labeled GFP. B, Passaged mUCMSC-labeled GFP.Figure 1 mUCMSC-labeled by GFP lentiviral vector transfection

2.2 體內(nèi)mUCMSC的分布和降解

0.4 mL生理鹽水懸浮的5×106個GFP標(biāo)記的mUCMSC，一次性注射到mdx小鼠腹腔后1 h、3 h、5 h，在小動物活體成像儀綠色熒光通道下觀察到腹壁下注射細胞的部位有明亮的綠色熒光集中分布，只是熒光輪廓不斷縮小(圖2A、2B、2C)。24 h后熒光強度明顯變?nèi)?(圖2D)，2只mdx小鼠甚至不能確定輪廓。一周后，所有小鼠腹部均觀察不到熒光信號。為進一步觀察腹腔內(nèi)部綠色熒光信號的分布，將mdx小鼠處死后剪開腹壁，暴露整個腹腔臟器，可在小動物活體成像儀綠色熒光通道下觀察到腹壁內(nèi)側(cè)和器官表面有少許熒光點分布(圖2E)，而注射未標(biāo)記GFP的mUCMSC的對照小鼠檢測不到典型的明亮綠色熒光的存在(圖2F)。為了觀察GFP標(biāo)記的mUCMSC在mdx小鼠體內(nèi)的降解變化趨勢，把實驗組(n=3)確定的熒光輪廓測定出平均熒光面積，mUCMSC注射后1 h、3 h、5 h平均熒光面積依次為(36.5±2.3) mm2、(33.8±2.6) mm2、(30.9±3.5) mm2。把確定不了熒光輪廓時和以后的平均熒光面積視為0，就可發(fā)現(xiàn)，熒光面積隨著細胞注射后的時間延長呈不斷縮減的趨勢(圖2G)，尤其是細胞注射后5 h后呈現(xiàn)快速消減趨勢。

注：A:注射后1 h；B:注射后3 h；C:注射后5 h；D:注射后24 h；E:注射后1周(168 h)腹腔內(nèi)臟；F:對照mdx小鼠；G：變化趨勢圖。圖2 局部注射GFP-mUCMSC后mdx小鼠腹部熒光信號分布及變化趨勢分析Note. A, 1 h after injection. B, 3 h after injection. C, 5 h after injection. D, 24 h after injection. E, Abdominal cavity 1 week after injection. F, Control mdx mice. G, Change tendency chart.Figure 2 Fluorescence signal distribution and change tendency analysis in the abdomen of mdx mice after local GFP-mUCMSC injection

2.3 鏡檢觀察膈肌內(nèi)mUCMSC的分布

注射細胞1周后的mdx小鼠膈肌冰凍切片內(nèi)，在熒光顯微鏡下，每只鼠的左、中、右部位均可在膈肌橫斷面觀察到少許綠色熒光信號散在分布(圖3A，3A-1,3A-2)，對照組小鼠膈肌橫斷面觀察不到綠色熒光信號(圖3B)。按照每個部位5個視野，每只鼠共計數(shù)15個視野(n=15)計算，每只鼠膈肌內(nèi)有(2.9±2.2)個綠色熒光信號，與未注射細胞的對照組有顯著差異(P﹤0.05)(圖3C)。

注：A：實驗組mdx小鼠(合成圖)；A-1：GFP；A-2：DAPI；B：對照mdx小鼠；C：比較分析圖。*P<0.05圖3 注射后1周mdx小鼠膈肌組織內(nèi)熒光信號分布鏡檢觀察及比較分析Note. A, Experiment group mdx mice(merged). A-1, GFP. A-2, DAPI. B, control mdx mice. C, Comparison analysis chart.*P<0.05Figure 3 Fluorescence signal distribution observed by fluorescence microscope in the diaphragm of mdx mice at 1 week post injection and comparison analysis

3 討 論

建立穩(wěn)定可靠的體內(nèi)示蹤技術(shù)，是動態(tài)監(jiān)測移植的間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)的遷移分布、開展間充質(zhì)干細胞藥代動力學(xué)研究的前提[8]。本研究顯示：按照最佳MOI值150的劑量加入慢病毒載體與mUCMSC共培養(yǎng)，可以成功使mUCMSC轉(zhuǎn)染GFP，在特定波長光照條件下發(fā)出綠色熒光，傳代3代，熒光亮度不會明顯衰減，這暗示GFP轉(zhuǎn)染標(biāo)記的mUCMSC可用于體內(nèi)短期示蹤。GFP基因轉(zhuǎn)染標(biāo)記的細胞，在特定波長的光照激發(fā)下就會發(fā)出綠色熒光[9]，結(jié)合活體成像技術(shù)，實現(xiàn)了對植入細胞的適時動態(tài)觀察。

靜脈途徑給藥是間充質(zhì)干細胞治療常用的方法，但我們的前期研究發(fā)現(xiàn)靜脈注射大量間充質(zhì)干細胞治療mdx小鼠極易引發(fā)小鼠栓塞死亡[7]。腹腔注射法操作簡單，不存在引發(fā)肺栓塞的危險，而且腹腔注射與靜脈注射間充質(zhì)干細胞的效果沒有差別[10-11]，本研究顯示：一次性腹腔注射大劑量細胞給腓腸肌、膈肌等肌組織進行性變性壞死的mdx小鼠，1 h后可在注射細胞的腹壁下觀察到明亮的綠色熒光集中分布，隨后熒光面積逐漸縮小，24 h后熒光面積大幅縮小，熒光強度明顯變?nèi)?，一周后，腹部觀察不到熒光信號，這與人臍帶間充質(zhì)干細胞在裸鼠體內(nèi)研究的報道類似[12]。為了進一步觀察腹腔內(nèi)部綠色熒光信號的分布，本研究將mdx小鼠處死后剪開腹壁，暴露整個腹腔臟器，可在小動物活體成像儀綠色熒光通道下觀察到腹壁內(nèi)側(cè)和器官表面有少許熒光點分布。這表明：注射到mdx小鼠腹腔內(nèi)的GFP標(biāo)記的mUCMSC在24 h之內(nèi)細胞數(shù)量在不斷減少或者細胞濃度在不斷降低。C57小鼠來源的mUCMSC，轉(zhuǎn)染GFP不會影響其免疫原性低的生物學(xué)特性。因此，注射同種異體mUCMSC到與C57小鼠同源的mdx小鼠腹腔，不會很快被mdx小鼠免疫細胞清除，注射到腹腔的細胞在mdx小鼠體內(nèi)可能存在1周，24 h內(nèi)腹壁熒光信號大幅減弱的主要原因是細胞濃度降低所致，很有可能與腸管蠕動造成的被動運動有關(guān)，也可能是受到全身肌肉損傷而產(chǎn)生的趨化因子的招募作用而形成的主動運動有關(guān)?；铙w成像技術(shù)不能觀察到注射細胞后1周的mdx小鼠腹腔存在明顯熒光時，采用熒光顯微鏡檢測方法還可在mdx小鼠膈肌內(nèi)觀察到熒光信號的存在，表明擅長于整體觀察的小動物活體成像儀檢測GFP熒光信號的靈敏度遠低于擅長于微觀觀察的熒光顯微鏡，注射到腹腔的mUCMSC可以進入膈肌，其遷移機制可能與mdx小鼠的損傷膈肌釋放的炎癥因子的靶向招募有關(guān)[13-14]，具體遷移及作用機制有待于進一步深入研究。