秦倩倩，吳瓊英*，賈俊強

(1.江蘇科技大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，鎮(zhèn)江 212018) (2.江蘇科技大學(xué) 糧食學(xué)院，鎮(zhèn)江 212004)

草魚為雅羅魚亞科草魚屬,俗稱鯇魚、黑青魚和油鯇等,一般喜棲居于江河湖泊等水域的中下層和多水草區(qū)域,是我國主要淡水魚之一,年產(chǎn)量達(dá)500萬噸以上[1]．草魚不僅肉質(zhì)肥嫩,而且味道鮮美,除了作為鮮活產(chǎn)品零售外,常被用于生產(chǎn)魚肉制品．魚皮約占魚體總重量的5%,是主要的下腳料之一,常被作為廢棄物丟棄,造成資源的浪費．研究表明,魚皮含有豐富的膠原蛋白,其中草魚皮的膠原蛋白含量高達(dá)蛋白總量的80%以上[2],是一種優(yōu)質(zhì)的膠原蛋白資源.

膠原蛋白是一種螺旋形纖維狀蛋白質(zhì),分子中氨基酸含量齊全,尤其脯氨酸含量最為豐富,其酶解產(chǎn)物具有抗氧化[3]、降血壓[4]和提高免疫力[5]等生物活性,是酶法制備生物活性肽的理想蛋白原料．目前已有從草魚皮膠原蛋白中制備生物活性肽的報道,如文獻(xiàn)[6]利用胰蛋白酶制備得到的草魚皮膠原蛋白肽具有抗氧化、降血壓以及抗菌的生物活性；文獻(xiàn)[7]利用木瓜蛋白酶制備的草魚皮膠原蛋白肽具有抗氧化活性．超聲波因操作簡便、高效、促進(jìn)酶解等優(yōu)點已被廣泛應(yīng)用于生物活性肽的制備[8-9]．然而,目前尚未有利用超聲輔助酶解法制備草魚皮膠原蛋白抗氧化肽的研究報道．文中以酶溶性草魚皮膠原蛋白為材料,以DPPH自由基清除率為評價指標(biāo),研究了底物濃度、加酶量、酶解溫度、酶解時間和超聲預(yù)處理等因素對酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響,以期為草魚皮膠原蛋白的綜合利用提供理論和技術(shù)支持．

1 實驗

1.1 材料與設(shè)備

草魚皮購自上海水產(chǎn)中心,切碎洗凈,用10%正丁醇浸泡24 h脫脂,用0.01 mol/L NaOH(含3%NaCl)浸泡24 h去雜蛋白．洗凈,用0.5 mol乙酸(含0.25%胃蛋白酶)浸提12 h,液料比30 ∶1．浸提液用0.9 mol/L NaCl鹽析24 h,然后5 000 r/min離心30 min,取沉淀,用8 000～12 000 kDa的透析袋透析24 h,凍干,備用[10]．

1,1-二苯基-2基苯肼(DPPH)，Sigma公司;堿性蛋白酶(200 U/mg)、胃蛋白酶(3 000 U/mg)、木瓜蛋白酶(800 U/mg)、中性蛋白酶(100 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)，上海源葉生物科技有限公司;正丁醇、乙酸、氯化鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等分析純，生工生物工程(上海股份)有限公司．

本實驗采用Q700 型超聲破碎儀，Qsonice公司.

1.2 酶解產(chǎn)物的制備

取獲得的膠原蛋白粉,按試驗設(shè)計配置不同濃度的膠原蛋白溶液,放入預(yù)設(shè)溫度的水浴鍋中,調(diào)節(jié)所需pH,加入蛋白酶,開始計時．酶解過程中不斷加入0.1 mol/L NaOH維持酸堿度在所需pH,酶解結(jié)束后沸水浴10 min滅酶,再5 000 r/min離心30 min,取上清液,調(diào)節(jié)pH至7.0，所得即為酶法提取草魚皮膠原蛋白酶解產(chǎn)物[11]．

1.3 DPPH自由基清除活性的測定

取2 mL樣品于試管中,加入2 mL濃度為0.04 g/L的DPPH無水乙醇溶液,混勻,避光反應(yīng)30 min,5 000 r/min離心10 min,取上清液,在517 nm測吸光值，記為A1.另取2 mL樣品于試管中,加入無水乙醇2 mL,反應(yīng)30 min,5 000 r/min離心10 min,取上清液，在517 nm測吸光值，記為A2.以2 mL 0.04 g/L DPPH無水乙醇溶液和2 mL無水乙醇反應(yīng)為參比,其吸光值記為A0．按式(1)計算待測樣品對DPPH自由基的清除率Y[12]:

Y=[1-(A1-A2)]/A0×100%

(1)

1.4 酶解用酶的篩選

以DPPH自由基清除率為指標(biāo),從堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶5種蛋白酶中篩選酶解用酶,篩選條件見表1.

表1 5種蛋白酶酶解條件

1.5 膠原蛋白酶解工藝優(yōu)化實驗

1.5.1 采用Design-Expert進(jìn)行Plackett-Burman(PB)試驗

通過PB試驗[13]篩選膠原蛋白酶解工藝中對DPPH自由基清除率影響較大的主因素．各因素及編碼水平設(shè)計見表2．

1.5.2 最陡爬坡試驗

按照PB試驗篩選出的對DPPH自由基清除率影響顯著的因素,以各因素效應(yīng)的正負(fù)、大小分別確定爬坡方向和變化步長,從而迅速逼近最大響應(yīng)值．最陡爬坡試驗除去影響顯著因素,其他各因素均保持不變．

表2 膠原蛋白酶解條件優(yōu)化的Plackett-Burman

1.5.3 Box-Behnken試驗

依據(jù)PB試驗確定的對DPPH自由基清除率影響顯著的因素,結(jié)合最陡爬坡試驗結(jié)果,確定Box-Behnken試驗各因素水平的中心點及步長[14]．試驗設(shè)計及數(shù)據(jù)分析借助Design-Expert 7. 1. 6 軟件進(jìn)行,Box-Behnken試驗設(shè)計因素及編碼水平見表3．

表3 膠原蛋白酶解條件優(yōu)化的Box-Behnken

1.6 超聲預(yù)處理對草魚皮膠原蛋白酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率的影響

以未處理的膠原蛋白為對照,研究膠原蛋白超聲10 min時,不同超聲功率(50、100、150、200、250 W)對膠原蛋白酶解多肽DPPH自由基清除率的影響,并在最優(yōu)超聲功率下研究不同超聲時間(5、10、15、20、25 min)對膠原蛋白酶解多肽DPPH自由基清除率的影響．其他酶解條件選用中心組合試驗確定的最優(yōu)條件．

1.7 超聲預(yù)處理對酶法提取草魚皮膠原蛋白水解度的影響

以未處理的膠原蛋白為對照,研究膠原蛋白超聲10 min時,不同超聲功率(50、100、150、200、250 W)對膠原蛋白水解度的影響,并在最優(yōu)超聲功率下研究不同超聲時間(5、10、15、20、25 min)對膠原蛋白水解度的影響．其他酶解條件選用中心組合試驗確定的最優(yōu)條件．

水解度測定選用pH-stat滴定法[15],計算公式見式(2)．

(2)

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解用酶的篩選

由圖1可見,堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率分別為55%、50.0%、47.6%、36.4%和34.9%,圖中字母a-e表示存在差異顯著(P<0.05).由圖可看出，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除效果最好，這可能是因為草魚皮膠原蛋白中含有較多的堿性蛋白酶酶切位點,酶切后產(chǎn)生了更多的活性肽——抗氧化肽．因此選用堿性蛋白酶作為草魚皮膠原蛋白的酶解用酶．

圖1 5種蛋白酶酶解多肽的DPPH自由基清除率Fig.1 DPPH free radical scavenging rate of five protease hydrolyzed peptides

2.2 Plackett-Burman試驗設(shè)計篩膠原蛋白酶解工藝的主要影響因素

以DPPH自由基清除率Y為指標(biāo),對pH(X1)、酶解溫度(X2)、酶解時間(X3)、加酶量(X4)、底物濃度(X5)等5個因素進(jìn)行全面考察,并等距插入2個虛擬變量(N1、N2),每個因素各設(shè)高(1)、低(-1)2個水平,共12組.PB試驗設(shè)計與結(jié)果見表4．加酶量為低水平(編碼2、3、7、8、9和12)時,酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率平均為53.8%,明顯低于高水平組(編碼1、4、5、6、10和11)的平均值57.4%,這說明加酶量對酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率有較大影響,且在一定范圍內(nèi)對其有促進(jìn)作用．實驗方差分析(表5)表明PB試驗回歸模型P<0.05,說明模型差異顯著,具有統(tǒng)計學(xué)意義;各因素對PPH自由基清除率影響作用依次為加酶量>溫度>酶解時間>pH>底物濃度．從表5可以看出,加酶量、酶解時間、溫度對酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率具有顯著影響(P<0.05),pH和底物濃度對DPPH自由基清除率影響不顯著(P>0.05)[13],因此試驗中確定pH為8、底物濃度為1%進(jìn)行后續(xù)試驗．

表4 膠原蛋白酶解條件優(yōu)化的Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果

表5 膠原蛋白酶解條件優(yōu)化的Plackett-Burman試驗結(jié)果的方差分析

注：**表示極顯著(P<0.01),*表示顯著(P<0.05)

2.3 最陡爬坡實驗分析膠原蛋白酶解的最佳條件

通過PB試驗篩選出顯著影響因素,再根據(jù)各因素的效應(yīng)大小、比例和變化方向進(jìn)行最陡爬坡試驗設(shè)計．對已篩選出的酶解溫度(X1)、酶解時間(X2)和加酶量(X3)進(jìn)行最陡爬坡設(shè)計試驗[16],結(jié)果見表6，從表中可發(fā)現(xiàn)第4組條件下的酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率最高,因此最佳條件在此附近．

表6 膠原蛋白酶解條件優(yōu)化的最陡爬坡試驗設(shè)計與結(jié)果

2.4 Box-Behnken試驗構(gòu)建膠原蛋白酶解工藝條件優(yōu)化的回歸模型

采用Design-Expert8.0.6.1軟件,進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken試驗設(shè)計，結(jié)果見表7．方差分析(表8)表明,此模型極顯著(P<0.01),系數(shù)R2為0.961 3>0.95,模型失擬項P=0.301 1>0.05,不顯著,說明模型擬合度良好[17]．從表7可以看出,各因素對膠原蛋白酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率的影響依次為:A(酶解時間)與B(酶解溫度)相同,與PB試驗結(jié)果基本一致,但略大于C(加酶量),可能是因為中心組合試驗中的加酶量步長變小引起的．此外A2、B2、C2、以及AC對Y值影響顯著(P<0.05),其余項不顯著(P>0.05),說明各因素對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系．

Design-Expert 8.0.6.1擬合后得到膠原蛋白酶解產(chǎn)物對DPPH自由基清除率(Y)關(guān)于自變量A(酶解時間)、B(酶解溫度)和C(加酶量)的回歸方程:

Y=79.23-1.98A-2.19B-0.34C-2.55AB+2.20AC-1.83BC-3.75A2-2.68B2-0.68C2，由回歸方程可以看出,方程的2次項系數(shù)均為負(fù)值,可知該回歸方程的響應(yīng)曲面開口朝下,因而存在極值點,可通過回歸方程確定最優(yōu)的酶解條件．

通過Design-Expert 8.06.1軟件分析回歸方程，得到草魚皮膠原蛋白最優(yōu)酶解條件為： 酶解時間3.0 h,酶解溫度46.5 ℃,加酶量7 025.2 U/g,在該條件下DPPH自由基清除率最高,且最高可達(dá)78.0%．經(jīng)3次驗證試驗,測定DPPH自由基清除率分別為77.6%、78.0%和78.9%,平均值為78.3%,和預(yù)測值78.0%十分接近,說明結(jié)果重現(xiàn)性良好,模型可靠,具有實用參考價值．

表7 膠原蛋白工藝條件優(yōu)化的Box-Behnken

表8 膠原蛋白酶解工藝條件優(yōu)化的Box-Behnken試驗結(jié)果的方差分析

注：**表示極顯著(P<0.01),*表示顯著(P<0.05)

2.5 超聲預(yù)處理對膠原蛋白酶解多肽的DPPH自由基清除率的影響

圖4、5分別為不同超聲功率和超聲時間預(yù)處理對草魚皮膠原蛋白酶解多肽的DPPH自由基清除率的影響.從圖中可看出，超聲對DPPH自由基清除率的影響呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,低功率、短時間蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化不大,對DPPH自由基清除率的影響有限,功率過大、時間過長時體系溫度上升,空化作用減弱,蛋白質(zhì)會重新聚成集體,溶解性降低,同時,蛋白的酶切位點可能會包埋起來,減少了與酶的接觸機會,從而酶解效果降低.因此,試驗中選用超聲功率100 W、超聲時間10 min，與文獻(xiàn)[18]研究結(jié)果類似．在此條件下，酶解產(chǎn)物DPPH清除率比未處理的提高了14.9%.

圖4 不同超聲功率預(yù)處理對草魚皮膠原蛋白酶解多肽的DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of different ultrasonic power pretreatment on DPPH free radical scavenging rate of collagen proteolytic peptide of grass skin

圖5 不同超聲時間預(yù)處理對草魚皮膠原蛋白酶解多肽的DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of different ultrasonic time pretreatment on DPPH free radical scavenging rate of collagen proteolytic peptide of grass carp skin

2.6 超聲預(yù)處理對膠原蛋白水解度的影響

圖6、7分別為不同超聲功率和預(yù)處理時間對草魚皮膠原蛋白水解度的影響.從圖中可發(fā)現(xiàn)，不同超聲預(yù)處理時間和功率對膠原蛋白水解度的影響具有相同趨勢,均隨著它們的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢[19],在超聲處理時間為10 min、功率為100 W時,水解度增幅最大,可從未處理的50.0%上升到60.3%,比未處理的提高20.6%．當(dāng)超聲功率過大(>100 W)或超聲時間過長時(>10 min)，水解度開始緩慢下降,這可能是短時間或低功率下超聲的機械波能使蛋白的顆粒細(xì)化[20],增加了酶與底物的接觸面積；但當(dāng)超聲時間過長或功率過大時,聲波累積的熱效應(yīng)使蛋白發(fā)生了聚集性折疊,導(dǎo)致溶解度下降,酶與底物的接觸面積減少,不利于反應(yīng)進(jìn)行[21]．

圖6 不同超聲功率預(yù)處理對草魚皮膠原蛋白水解度的影響Fig.6 Effect of different ultrasonic power pretreatment on the hydrolysis degree of grass skin collagen

圖7 不同超聲時間預(yù)處理對草魚皮膠原蛋白水解度的影響Fig.7 Effect of different ultrasonic time pretreatment on the hydrolysis degree of collagen in grass carp skin

3 結(jié)論

本研究篩選出了堿性蛋白酶是制備草魚皮膠原蛋白抗氧化肽的最佳蛋白水解酶,確定了酶解時間、酶解溫度和加酶量對酶解產(chǎn)物的抗氧化活性具有顯著影響;在最陡爬坡試驗的基礎(chǔ)上,利用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計優(yōu)化出最優(yōu)酶解條件為:酶解時間3.0 h、酶解溫度46.5 ℃和加酶量7 025.2 U/g,在此條件下,草魚皮膠原蛋白酶解產(chǎn)物對DPPH自由基清除率可達(dá)78.3%,為理論值的100.4%．在最優(yōu)酶解條件的基礎(chǔ)上,利用超聲預(yù)處理優(yōu)化出了超聲輔助酶解的最佳條件為:超聲時間10 min、超聲功率100 W,在此條件下,酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率比未處理的提高了14.9%左右，水解度提高了20.6%．

綜上所述,超聲預(yù)處理能夠有效提高草魚皮膠原蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化活性．文中研究結(jié)果為草魚皮的深加工提供了技術(shù)支持．