唐 楠 劉方圓 郭 振 馬淑青 樊 迪 楊 振 唐其柱

以阿霉素(doxorubicin，DOX)為代表的蒽環(huán)類藥物被廣泛用于乳腺癌、白血病等多種惡性腫瘤的臨床治療，然而，心臟毒性是阿霉素嚴(yán)重的、致命的不良反應(yīng)，也因此限制了該類藥物在腫瘤治療中的應(yīng)用。阿霉素的心臟毒性不良反應(yīng)包括心律失常、心肌病、心肌梗死、左心室功能障礙和心力衰竭[1, 2]。阿霉素引起充血性心力衰竭(CHF)的發(fā)生率與總劑量有關(guān)[3, 4]。一項大規(guī)模回顧性分析觀察到阿霉素累積劑量達(dá)400mg/m2，心力衰竭的發(fā)生率為5%，累積劑量達(dá)550mg/m2和700mg/m2時，心力衰竭發(fā)生率分別為26%、48%，在累積劑量超過400mg/m2后，年齡較大的患者(>65歲)CHF發(fā)生率更高[5]。Cardinale等[6]組織的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)蒽環(huán)類藥物治療后的心臟毒性大多發(fā)生在第1年之內(nèi)，心臟毒性的發(fā)生與蒽環(huán)類藥物劑量和治療結(jié)束時的LVEF有關(guān)。近年來大量實驗研究發(fā)現(xiàn)阿霉素所致心肌損傷表現(xiàn)為氧化應(yīng)激的增加和拓?fù)洚悩?gòu)酶的抑制，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生增加、細(xì)胞DNA的損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣失調(diào)、線粒體功能障礙、能量代謝失衡，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)重塑[7, 8]。盡管大量的實驗研究揭示了阿霉素所致的心臟損傷的機制，但許多抗氧化劑似乎沒有太大的心臟保護作用，傳統(tǒng)的心血管病藥物(如β受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑)的保護作用也非常有限[9]。目前尚缺乏對阿霉素所致心臟損傷的監(jiān)測、預(yù)防和治療手段[10]。因此，尋找阿霉素作用的新靶點仍然是一項挑戰(zhàn)。

Toll樣受體家族(Toll-like receptors，TLRs)是在序列和功能上高度保守的蛋白質(zhì)分子系列，在炎癥、免疫、腫瘤中發(fā)揮著重要作用。Toll樣受體9(TLR9)作為一種細(xì)胞內(nèi)的重要模式識別受體，主要在樹突細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞中表達(dá)，包括心肌在內(nèi)的幾個器官的非免疫細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了TLR9的表達(dá)[11, 12]。TLR9參與機體固有免疫、發(fā)揮抗病毒作用；還可以通過激活 NF-κB以及MAPKs，誘發(fā)免疫炎性反應(yīng)，并參與細(xì)胞自噬過程[13]。研究發(fā)現(xiàn)，TLR9相關(guān)的信號通路在眾多的心血管疾病的病理生理發(fā)展機制中具有重要作用，參與心肌細(xì)胞的炎性反應(yīng)，誘導(dǎo)線粒體功能障礙和死亡，進而導(dǎo)致心肌收縮功能障礙[14, 15]。因此本研究推測TLR9可能參與阿霉素所致的心肌損傷的發(fā)生、發(fā)展過程，并且目前尚缺乏TLR9在阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷中的作用的實驗研究，本研究擬通過體內(nèi)外實驗探究TLR9對阿霉素性心肌損傷的影響及機制。

材料與方法

1.主要材料:C57B/6J、TLR9-KO小鼠購自北京華富康生物科技有限公司；H9C2細(xì)胞購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫；ODN2088購買于德國Miltenyi公司；鹽酸阿霉素(DOX)購自北京索萊寶科技有限公司;TUNEL試劑盒購自瑞士Roche 公司；GAPDH、Bax、Bcl-2、C-caspase-3抗體均購自美國Cell Signaling Technology 公司。

2.實驗分組及模型建立:在體實驗分為WT組、TLR9-KO組、WT+DOX組、TLR9-KO+DOX組；選取8周齡健康雄性C57B/6J、TLR9-KO小鼠(22～26g)，隨機分為4組，WT組、TLR9-KO組小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液10ml/kg，分別于0、7、14、21天皮下注射,為對照組；WT+DOX組、TLR9-KO+DOX組小鼠腹腔注射阿霉素10mg/kg，分別于0、7、14、21天皮下注射，為模型組。離體實驗分為PBS組、PBS+ODN2088組、DOX組、DOX+ODN2088組；大鼠來源H9C2細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞濃度達(dá)80%時傳代培養(yǎng)并制備細(xì)胞爬片，PBS組為對照組，DOX組加入1μmol/L DOX構(gòu)建細(xì)胞DOX模型，PBS+ODN2088組、DOX+ODN2088組加入0.2μmol/L ODN2088。

3.檢測心肌損傷標(biāo)志物:造模第3天取小鼠眶靜脈血，離心取上清，檢測血清中乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)的含量。

4.檢測心功能及血流動力學(xué)指標(biāo):造模第28天檢測小鼠心功能，備皮，充分暴露小鼠胸前區(qū)，1.5%異氟烷麻醉，使用高頻超聲探測儀測量并記錄左心室厚度、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(IVESD)、舒張末期室間隔厚度(IVSd)和左心室短軸縮短率(FS%)。應(yīng)用PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)描記壓力-容積曲線，測量血流動力學(xué)指標(biāo)，等容收縮期左心室內(nèi)壓力上升的最大速率(dp/tmax)以及等容舒張期左心室壓力下降的最大速率(dp/dtmin)。隨后解剖小鼠心臟，稱重，并計算心重/脛骨長。將分子生物學(xué)檢測用的心臟組織置于液氮，并儲存在-80℃，供后續(xù)實驗用；將病理學(xué)染色用的心臟組織置于10%KCl溶液中，使心臟停搏于舒張期。

5.病理學(xué)染色:將取出的心臟組織用甲醛固定，石蠟包埋后制備組織石蠟切片，進行TUNEL染色，TUNEL染色完畢后于免疫熒光鏡下拍照，以供分析心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。

6.Western blot法檢測心肌細(xì)胞Bax、Bcl-2、C-caspase-3的含量：提取實驗小鼠心臟組織蛋白，進行BCA 定量，制備上樣蛋白，進行10% SDS-PAGE電泳，分離蛋白后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，分別與抗Bax、Bcl-2、C-caspase-3、gapdh抗體于 4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗(1∶5000) 室溫孵育1h，TBST 洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光后成像系統(tǒng)進行圖像采集。

結(jié) 果

1.TLR9對阿霉素誘導(dǎo)的急性心肌損傷的影響:在DOX皮下注射后的第3天，檢測血清中的心肌損傷標(biāo)志物，結(jié)果顯示給予DOX刺激后，小鼠的心肌酶明顯高于相應(yīng)的對照組(P<0.05)，CK-MB和LDH的值幾乎是對照組的2倍，然而，與野生型小鼠比較，TLR9敲除小鼠在DOX刺激后的心肌損傷程度明顯降低(P<0.05)，詳見圖1。

圖1 TLR9對阿霉素所致小鼠心肌損傷的影響A.CK-MB;B.LDH。*P<0.05

2.TLR9對阿霉素誘導(dǎo)的慢性心肌損傷的影響：給予DOX刺激后的28天，與對照組比較，DOX刺激后的小鼠的短軸縮短率減低(P<0.05)，而敲除TLR9后，心功能得到了改善，短軸縮短率明顯增加(P<0.05)，dP/dtmax、dP/dtmin也高于WT+DOX組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1。另外，通過HE染色觀察心肌細(xì)胞橫截面積，DOX刺激可減小心肌細(xì)胞橫截面積(P<0.05)，TLR9敲除減輕了這一效應(yīng)，DOX刺激后，TLR9敲除組小鼠心肌細(xì)胞橫截面積大于野生型(P<0.05)，詳見圖2。

表1 各組小鼠心功能指標(biāo)

與WT組比較，*P<0.05；與WT+DOX組比較，#P<0.05

3.TLR9減輕阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷的機制：通過Western blot法實驗，筆者發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，給予DOX刺激小鼠的BAX、C-caspase-3的蛋白表達(dá)量明顯增高(P<0.05)，Bcl-2的表達(dá)量明顯降低(P<0.05)， 同樣給予DOX刺激，TLR9敲除鼠的BAX、C-caspase-3的表達(dá)量的增加并不明顯(P<0.05)；相反，Bcl-2的表達(dá)量卻比野生型小鼠有所增加(P<0.05)，詳見圖2。筆者又通過TUNEL檢測了細(xì)胞凋亡的程度，結(jié)果顯示，與對照組比較，DOX組小鼠的細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.05)，而TLR9敲除可明顯降低DOX所致的心肌細(xì)胞凋亡程度(P<0.05)，詳見圖3。

圖2 各組小鼠心肌Bax、Bcl-2、C-caspase-3的表達(dá)情況A.蛋白質(zhì)電泳圖;B.分別為Bax、C-caspase-3、Bcl-2的蛋白定量圖。*P<0.05

圖3 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色,×200)*P<0.05

4.TLR9抑制劑降低阿霉素所致細(xì)胞凋亡：DOX刺激后，相比于對照組H9C2細(xì)胞的凋亡顯著增加(P<0.05)，而在給予TLR9抑制劑ODN2088之后，H9C2細(xì)胞凋亡程度比DOX組明顯減輕(P<0.05)，詳見圖4。

圖4 各組H9C2的凋亡情況(TUNEL染色,×200)*P<0.05

討 論

阿霉素作為一種臨床上廣泛使用的化療藥物，其發(fā)揮抗癌作用主要是通過插入細(xì)胞DNA，干擾拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ-DNA裂解復(fù)合物，阻礙 DNA的重新連接和雙鏈切割修復(fù)，從而阻斷細(xì)胞DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，殺死癌細(xì)胞。阿霉素的這種作用直接導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷、活性氧的產(chǎn)生以及細(xì)胞凋亡[9, 16]。也因此不可避免地帶來一系列抗癌不良反應(yīng)，其中，心臟毒性便是最為突出和致命的一種，也因而限制了其在腫瘤患者中的應(yīng)用，降低了腫瘤患者的預(yù)后。

本研究發(fā)現(xiàn)，DOX刺激早期小鼠血清心肌損傷標(biāo)志物明顯升高，表明DOX可導(dǎo)致心肌細(xì)胞的急性損傷，而且在DOX誘導(dǎo)心肌損傷的慢性模型中，筆者發(fā)現(xiàn)小鼠心功能受到損傷，短軸縮短率明顯下降，心肌細(xì)胞橫截面積相比于對照組也明顯縮小，檢測的凋亡相關(guān)指標(biāo)也明顯升高，而Bcl-2卻明顯減低，表明DOX導(dǎo)致心肌細(xì)胞萎縮，凋亡增加，TUNEL染色也證實了這一點。然而當(dāng)敲除TLR9后，DOX所致的急性心肌損傷得到緩解，LDH、CK-MB相比于野生型小鼠明顯降低，此外，在慢性心肌損傷模型中，敲除TLR9后，小鼠的心功能也明顯得到改善，短軸縮短率顯著升高，此外TLR9敲除鼠的心肌細(xì)胞橫截面積也有所增加。相比于野生型小鼠，BAX、C-caspase-3的蛋白表達(dá)量在TLR9敲除鼠也明顯降低，而保護細(xì)胞免于凋亡的Bcl-2蛋白表達(dá)較對照組上調(diào)，TUNEL染色也支持TLR9減輕DOX所致心肌細(xì)胞凋亡這一結(jié)論。通過離體細(xì)胞實驗，筆者發(fā)現(xiàn)當(dāng)抑制了TLR9的作用后，DOX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也受到抑制。因此，TLR9敲除可能通過抑制細(xì)胞凋亡減輕DOX所致心肌損傷。

TLR9作為Toll樣受體家族的一員，大量研究證實了其在炎性反應(yīng)中發(fā)揮舉足輕重的作用。在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心力衰竭模型中發(fā)現(xiàn)，敲除TLR9減輕了心肌組織的炎癥和心臟功能障礙[15]。持續(xù)的激活TLR9，會增加心肌組織和全身的炎性反應(yīng)，并且使SERCA2a特異性敲除的舒張期心力衰竭的心臟功能更加惡化[17]。在急性心肌梗死模型中發(fā)現(xiàn)mtDNA可以通過激活TLR9，從而激活NF-κB，導(dǎo)致心肌細(xì)胞出現(xiàn)線粒體功能障礙和死亡[18]。在動脈粥樣硬化小鼠模型，TLR9通過誘導(dǎo)產(chǎn)生多種促炎因子、趨化因子及其受體的迅速表達(dá)，進而促進細(xì)胞因子的產(chǎn)生，啟動炎性反應(yīng)，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生[19]。

在阿霉素所致心肌損傷中，DNA損傷、氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此，推測TLR9敲除可能通過減輕炎性反應(yīng)、降低氧化應(yīng)激從而抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮保護阿霉素所致心肌損傷的作用。有研究發(fā)現(xiàn)在阿霉素誘導(dǎo)的急性炎性反應(yīng)中，免疫細(xì)胞的凋亡起著關(guān)鍵作用，而TLR-2/TLR-9-MyD88信號通路在啟動對凋亡這種免疫原性形式的炎性反應(yīng)中起核心作用[20]。此外，TLR9也能被從自噬中逃逸的受損線粒體DNA激活，引發(fā)心肌細(xì)胞炎性發(fā)應(yīng)，并引發(fā)心肌炎和擴張型心肌病[21]。因此推測在阿霉素介導(dǎo)的心臟損傷中也可能發(fā)生類似的機制，但仍然需要更完善的實驗進一步探究TLR9在阿霉素所致心肌損傷中的作用機制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TLR9敲除可以改善DOX小鼠的心功能，通過抑制凋亡減輕阿霉素所致心肌損傷，這可能為臨床預(yù)防及治療阿霉素性心肌損傷提供新的方向，但其具體作用機制仍有待于開展深入的實驗探討。