李 棟， 張立攀， 李向力， 趙夢瑤， 劉紅偉

（河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司，鄭州 450002）

苦蕎麥學(xué)名韃靼蕎麥（Fagopyrum tataricum），被譽(yù)為“五谷之王”［1］，被評選為新型藥食同源食物［2］. 苦蕎本身具有很高的營養(yǎng)和保健價(jià)值：其淀粉含量59%～80%；苦蕎蛋白（清蛋白和球蛋白）組成占其蛋白總含量的48%；苦蕎的脂肪含量為2%～3%，包括10種脂肪酸；苦蕎維生素含量明顯比大米和小麥高；苦蕎擁有人體必須礦物質(zhì)元素，尤其鐵元素含量是其他作物的3～5.5 倍；苦蕎不含糖和膽固醇［3］，具有很多生物活性成分，有降低毛細(xì)血管脆性和改善微循環(huán)的作用［4］.

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，苦蕎含有黃酮等多種具有降血糖作用的生物活性因子，有降血糖的功能. 從苦蕎中提取黃酮的方法很多，如熱水浸提法［5-6］、醇提取法［7-8］、索氏提取法［9］、超聲波提取法［10-12］和HPLC法［13］. 本試驗(yàn)嘗試?yán)贸曒o助乙醇提取苦蕎黃酮，并與輔料硬脂酸鎂、富鉻酵母，微晶纖維素按一定比例混合［14］，參照膠囊制備工藝制備苦蕎黃酮降血糖產(chǎn)品，研究產(chǎn)品穩(wěn)定性，為今后苦蕎黃酮的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與儀器

1.1 材料

苦蕎（上海極蕎生物科技有限公司）；蘆丁對照品（上海源葉生物科技有限公司）；輔料為硬脂酸鎂、富鉻酵母和微晶纖維素；硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、乙醇等均為分析純.

1.2 儀器

XTP-500A型高速多功能搖擺粉碎機(jī)（浙江永康市紅太陽機(jī)電有限公司）；SXT-06 索氏提取器（上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司）；SCIENIZ-ⅡD 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；AB135-S電子天平（梅特勒-托利多（中國））；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）.

2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

參考文獻(xiàn)［15-16］略作修改：準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)品，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇配制0、1、2、3、4、5 μg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)使用液；分別吸蘆丁標(biāo)準(zhǔn)使用液1 mL于錐形瓶中，加入0.5 mL 5%NaNO2溶液，混勻靜置6 min；加入0.5 mL 10%Al（NO3）3混勻靜置6 min；最后加入4 mL 4%NaOH溶液混勻放置12 min，并于510 nm處測吸光值. 以橫坐標(biāo)（x）為蘆丁濃度，縱坐標(biāo)（y）為光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2.2 工藝優(yōu)化

2.2.1 原料的處理 將苦蕎洗凈，用烘箱50 ℃烘干，粉碎，過60目篩備用.

2.2.2 試驗(yàn)方法

1）單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì). 苦蕎黃酮在提取過程主要影響因素有料液比（苦蕎（g）∶乙醇（mL））、乙醇體積分?jǐn)?shù)（%）、超聲時(shí)間（min）和提取溫度（℃）. 以黃酮得率為指標(biāo)，分別對這4個(gè)影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)研究，確定最佳范圍. 黃酮得率計(jì)算公式如下：

式中：Y 為黃酮得率（%）；C 為黃酮質(zhì)量濃度（g/L）；V 為待測液體積（L）；N為稀釋的倍數(shù)；m為稱量樣品的質(zhì)量（g）.2）試驗(yàn)優(yōu)化. 對料液比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、超聲時(shí)間（C）、提取溫度（D）4個(gè)單因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，每個(gè)因素均設(shè)置3 個(gè)水平，進(jìn)行工藝試驗(yàn)優(yōu)化，通過正交試驗(yàn)助手進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（表1）.

2.3 制備苦蕎黃酮膠囊顆粒

2.3.1 苦蕎黃酮的提取 按最佳工藝提取苦蕎黃酮，放置于真空干燥箱（溫度設(shè)置60 ℃）烘干，粉碎過60目篩收集備用.

2.3.2 制備膠囊內(nèi)容物 參考文獻(xiàn)［17］膠囊制備工藝略作修改：①選微晶纖維素、富鉻酵母、硬脂酸鎂作為輔料，與苦蕎黃酮按質(zhì)量比配制（苦蕎黃酮∶硬脂酸鎂∶富鉻酵母∶微晶纖維素=1.46∶0.04∶0.05∶1.15）后測定混合粉末的相對臨界濕度［18］；②將實(shí)驗(yàn)室濕度控制在相對臨界濕度值以下，用85%的食品級乙醇作溶濕劑，制備膠囊顆粒，收集20～60目顆粒于真空干燥箱60 ℃烘4 h，測其休止角［19］；③手工制作膠囊，每粒膠囊質(zhì)量控制在0.5 g左右.

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Tab.1 Level of orthogonal experimental factors

2.3.3 計(jì)算膠囊裝樣量差異 取10粒膠囊，精確稱取每粒膠囊的質(zhì)量記為m1，再將其內(nèi)容物完全倒出稱重，記為m2，計(jì)算平均裝樣量和裝樣量差異.

2.4 膠囊保質(zhì)期試驗(yàn)

采用保溫加速試驗(yàn)［20-22］進(jìn)行考察. 將裝有內(nèi)容物的膠囊裝于包裝盒內(nèi)密封，置于恒溫培養(yǎng)箱（40 ℃±2 ℃），相對濕度控制在75%±5%（飽和NaCl溶液），放置6個(gè)月. 依據(jù)文獻(xiàn)［23］檢測各項(xiàng)指標(biāo)：感官性狀、產(chǎn)品功效成分（黃酮含量）、水分含量（%）、崩解時(shí)限（min）和藥品含量（mg/粒）.

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分析

蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.292 2x-0.004 9（R2=0.999 4），圖1顯示蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度與吸光度值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系.

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

3.2.1 料液比對苦蕎黃酮得率的影響 準(zhǔn)確稱取苦蕎粉末1.00 g，用60%乙醇進(jìn)行溶解，超聲30 min，料液比的梯度設(shè)置為1∶3、1∶6、1∶12、1∶24、1∶48，提取溫度設(shè)置為85 ℃. 從圖2可以看到，隨著溶劑比例的增加，黃酮的得率在料液比為1∶6時(shí)達(dá)到最高. 以后隨著溶劑的增加，苦蕎黃酮得率平緩下降，故苦蕎與乙醇的料液比為1∶6比較適宜.

3.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對苦蕎黃酮得率的影響 精確稱取1.00 g 苦蕎粉末，料液比設(shè)置為1∶6，超聲時(shí)間30 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)置為30%、40%、50%、60%、70%，提取溫度設(shè)置為85 ℃.從圖3可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加苦蕎黃酮的得率逐漸增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，黃酮得率達(dá)到了最高值，以后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加黃酮得率呈輕微下降態(tài)勢，故乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)置為60%左右為宜.

3.2.3 超聲時(shí)間對苦蕎黃酮得率的影響 精確稱取1.00 g苦蕎粉末，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇進(jìn)行溶解，料液比設(shè)置為1∶6，超聲時(shí)間設(shè)置為10、20、30、40、50 min，提取溫度設(shè)置為85 ℃. 從圖4 可以看出，隨著超聲時(shí)間的延長，苦蕎黃酮得率呈現(xiàn)明顯增加，30 min 后開始下降，故超聲時(shí)間選30 min較為適宜.

圖2 料液比對苦蕎黃酮的得率的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on the yield of tartary buckwheat flavonoids

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對苦蕎黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on the yield of tartary buckwheat flavonoids

圖4 超聲時(shí)間對苦蕎黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the yield oftartary buckwheat flavonoids

3.2.4 提取溫度對苦蕎黃酮得率的影響 精確稱取1.00 g苦蕎粉末，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇進(jìn)行溶解，料液比設(shè)置為1∶6，超聲時(shí)間設(shè)置為30 min，提取溫度分別設(shè)置為55、65、75、85、95 ℃.

從圖5 可以看出，隨著提取溫度的增加，苦蕎黃酮的得率呈現(xiàn)輕微上升趨勢，溫度為85 ℃時(shí)，苦蕎黃酮的得率最高，故提取溫度設(shè)為85 ℃左右較為適宜.

3.3 苦蕎黃酮提取工藝的優(yōu)化

通過表2，表3 可以看出，對提取苦蕎黃酮得率的影響順序?yàn)锽、D、C、A. 通過方差分析看出，乙醇的體積分?jǐn)?shù)在整個(gè)提取過程中影響顯著. 最佳提取小組為A3B2C2D1，即料液比1∶8、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲時(shí)間30 min、提取溫度80 ℃. 驗(yàn)證其準(zhǔn)確性，采用最佳工藝條件平行3次得到的提取得率均值為2.48%，實(shí)際值與理論值相近.

圖5 提取溫度對苦蕎黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the yield of tartary buckwheat flavonoids

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Orthogonal experiment design and results

表3 苦蕎黃酮的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Tab.3 Variance analysis of orthogonal test results of tartary buckwheat flavonoids

3.4 制備膠囊顆粒的結(jié)果分析

3.4.1 混合粉末相對臨界濕度 配置不同體積分?jǐn)?shù)的硫酸，使干燥器中的相對濕度為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%. 將一定比例混合好的粉末（苦蕎黃酮與輔料的混合物）置于其中，室溫放置96 h后測吸濕率.通過Origin軟件以切線法求出臨界相對濕度為67.5%. 通過圖6可以看出在相對濕度小于67.5%時(shí)混合粉末的吸濕率有增高趨勢但變化不大，但當(dāng)大于67.5%時(shí)混合粉末的吸濕率增高變化十分明顯. 故在制備顆粒時(shí)實(shí)驗(yàn)室濕度需控制在67.5%以下.

3.4.2 休止角 通過表4 可以看出，苦蕎黃酮膠囊顆粒的休止角為39.39°，休止角小于40°，說明制備的顆粒具有良好的流動性.

表4 休止角的測定Tab.4 Measurement of repose angle

圖6 臨界相對濕度Fig.6 Critical relative humidity

3.4.3 裝樣量差異分析《中國藥典（2015 版）》膠囊要求：平均裝量在0.3 g（含0.3 g）以上時(shí)裝樣量差異限度為±7.5%. 表5顯示本試驗(yàn)平均裝樣量為0.413 05 g，裝樣量差異在±7.5%內(nèi)，符合《中國藥典》的要求.

表5 裝樣量差異測定Tab.5 Determination of difference in sample loading

3.5 膠囊穩(wěn)定性試驗(yàn)分析

通過表6穩(wěn)定性試驗(yàn)的結(jié)果可以看出，在6個(gè)月時(shí)間里，產(chǎn)品的形狀、顏色、氣味、質(zhì)量、水分、黃酮含量及崩解時(shí)限均符合《中國藥典（2015版）》膠囊劑的質(zhì)量要求，制備的苦蕎黃酮降血糖產(chǎn)品穩(wěn)定性良好.

表6 苦蕎黃酮膠囊加速穩(wěn)定性試驗(yàn)Tab.6 Accelerated stability test of tartary buckwheat flavone capsules

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過正交試驗(yàn)以乙醇做溶劑提取苦蕎黃酮，選輔料微晶纖維素、富鉻酵母、硬脂酸鎂混合制備膠囊顆粒，并對膠囊的穩(wěn)定性進(jìn)行研究. 結(jié)論如下：

1）提取苦蕎黃酮的最佳工藝條件為料液比1∶8、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲時(shí)間30 min、提取溫度80 ℃，此工藝條件下對提取得率的影響順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)、提取溫度、超聲時(shí)間、料液比，并測其得率為2.48%.

2）以微晶纖維素、富鉻酵母和硬脂酸鎂為輔料，體積分?jǐn)?shù)85%的食品級乙醇為溶濕劑制粒，測其休止角為39.39°，表明其流動性很好.

3）制備膠囊，并測得其平均裝樣量為0.413 05 g，平均裝樣量差異很小. 采用保溫加速試驗(yàn)方法測膠囊穩(wěn)定性，各項(xiàng)指標(biāo)均在質(zhì)量規(guī)定范圍內(nèi)，表明藥物性質(zhì)比較穩(wěn)定.