蔡昭煒 趙 麗 何少娟 李雪玲

1.廣東省東莞市松山湖中心醫(yī)院(523326)；2.廣東省東莞市人民醫(yī)院

弱精癥是導(dǎo)致男性不育癥的主要因素之一[1-2]，引起弱精癥的病因多種多樣，其發(fā)病機(jī)制仍是困擾生殖學(xué)術(shù)界的一大難題[3-4]。已有多個(gè)研究報(bào)道，男性精液中的蛋白質(zhì)主要由SEMG1基因編碼的蛋白構(gòu)成，主要參與精液凝膠基質(zhì)的構(gòu)成，對(duì)射精前的精子起到固定保護(hù)作用，射精時(shí)凝膠被前列腺特異抗原PSA酶分解，使精子從基質(zhì)中釋放出來，這就是精子液化過程[5-6]。當(dāng)SEMG1基因表達(dá)異常升高時(shí)，會(huì)造成精子液化效率低下，使精子數(shù)量和活力降低導(dǎo)致不育癥發(fā)生[7]。本研究通過分析弱精癥患者精子SEMG1基因表達(dá)及體外受精結(jié)局，探討SEMG1基因?qū)δ行圆挥Y中的影響，為闡明弱精癥的生物學(xué)機(jī)制提供理論支持，也為弱精癥的診斷標(biāo)志物和男性避孕藥物的開發(fā)提供新的啟發(fā)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年1月-2019年1月在東莞市第三人民醫(yī)院生殖中心就診的34例男性不育患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①自愿簽署知情同意書；②經(jīng)過檢查后分別確診為患輕度弱精癥、中重度弱精癥及未患弱精癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并性功能障礙史；②合并生殖器創(chuàng)傷史；③合并遺傳疾病或精神疾?。虎芎喜⒉G丸及輸精管結(jié)扎術(shù)史。本研究通過了東莞市第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

34例患者均在禁欲2～7d后采集精液，依據(jù)WHO第5版《人類精液檢查與處理的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》[8]標(biāo)準(zhǔn)檢測標(biāo)本，獲取精液常規(guī)分析的精子濃度、總數(shù)以及前向運(yùn)動(dòng)精子百分率的測量值。計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)(CASA)分析儀選用美國哈密爾頓精子質(zhì)量分析儀。采用Percoll不連續(xù)梯度法處理精液，收集沉淀精子提取RNA，進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測精子SEMG1基因表達(dá)，引物序列見表1。RNA提取試劑盒Maxima Reverse Transcriptase均購自德國Qiagen公司，LightCycler480型熒光定量PCR儀購自美國Roche公司。獲取患者體外受精結(jié)局。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 精子常規(guī)參數(shù)

34例年齡22～50歲，根據(jù)精子活力(PR)值分為非弱精12例(≥32%)，輕度弱精10例(20%～32%)，中重度弱精12例(0～20%)。各組精液常規(guī)參數(shù)見表2。

表2 各組精液常規(guī)參數(shù)比較

2.2 PCR檢測精子SEMG1基因表達(dá)

檢測結(jié)果顯示，精子SEMG1的基因表達(dá)輕度弱精癥組高于非弱精組，中重度弱精癥高于輕度弱精癥組(P<0.0001，圖1)(1720頁)。

2.3 免疫熒光染色檢測精子SEMG1蛋白表達(dá)

結(jié)果顯示，精子SEMG1蛋白表，中重度弱精癥組最高，輕度弱精癥次之，非弱精組最低(P<0.05，圖2)(1720頁)。

2.4 SEMG1表達(dá)水平與體外受精結(jié)局

分別對(duì)不同體外受精結(jié)局患者的精子SEMG1基因和蛋白表達(dá)進(jìn)行分析:在基因水平，體外受精<50%的精子SEMG1表達(dá)高于體外受精≥50%的精子(P<0.0001，圖3a)(1720頁)；蛋白水平也同樣趨勢(shì)，免疫熒光結(jié)果顯示，體外受精<50%的精子SEMG1的蛋白表達(dá)水平高于體外受精≥50%的精子(P<0.0001，圖3b)(1720頁)。

3 討論

弱精癥是導(dǎo)致男性不育的主要因素之一。張國暉[9]等分別從基因突變、線粒體DNA突變、miRNA調(diào)控異常以及精子端粒長度改變等4個(gè)方面，綜述了目前對(duì)于弱精癥發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)現(xiàn)狀,弱精癥發(fā)病機(jī)制仍需更多探索。由SEMG1基因編碼的精原蛋白在附睪中高度表達(dá)，是影響射精精子凝膠包埋的主要蛋白，這些蛋白質(zhì)共有的抗原表位位于精子的運(yùn)動(dòng)部位[10-12]。在精液液化過程中，激肽釋放酶相關(guān)肽酶3(KLK3，又稱前列腺特異性抗原)將精原蛋白降解為低分子量片段，凝膠溶解，精子被釋放并逐漸運(yùn)動(dòng)[10-13]?？梢奡EMG1及其編碼的蛋白是調(diào)控精子液化、運(yùn)動(dòng)和活力的因素。有研究指出，SEMG1基因有望成為診斷弱精癥的潛在候選基因之一，這更加說明SEMG1基因與弱精癥間具有密切的相關(guān)性。

本研究輕度弱精癥男性精子SEMG1基因表達(dá)高于非弱精癥男性，中重度弱精癥者SEMG1基因表達(dá)最高，故認(rèn)為隨著弱精癥病情加劇， SEMG1基因表達(dá)與病情程度成正相關(guān)，導(dǎo)致體外受精成功率降低，提示精子SEMG1在基因水平上調(diào)導(dǎo)致其蛋白表達(dá)水平的升高。此外，SEMG1蛋白也同樣，弱精癥較重患者其精子SEMG1蛋白表達(dá)升高，說明在蛋白水平弱精癥患者精子SEMG1的表達(dá)較非弱精癥者顯著升高，且與病情呈正相關(guān)。郭小彬[3]等通過高表達(dá)大鼠SEMG1基因成功建立了弱精癥大鼠模型；喬素冬[13]通過對(duì)比正常男性和弱精癥男性發(fā)現(xiàn)，SEMG1基因在弱精癥男性精子中表達(dá)明顯上調(diào)。SEMG1基因廣泛表達(dá)在射精精子中，同時(shí)在睪丸、附睪和前列腺中也有少量表達(dá)。精原蛋白1是構(gòu)成精液凝膠的主要成分，凝膠狀精子不具備運(yùn)動(dòng)活力[14-16]，當(dāng)精原蛋白1與前列腺分泌的Zn2+結(jié)合后，前列腺抗原被激活進(jìn)而分解凝膠精子中的精原蛋白1，產(chǎn)生具有抑制精子活性和抗菌活性的小分子多肽片段[11]。精子的活性與液化是影響精子獲能的必要因素，是精子實(shí)現(xiàn)向前運(yùn)動(dòng)的必要條件。本研究發(fā)現(xiàn)與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。

文獻(xiàn)報(bào)道和本研究均發(fā)現(xiàn)SEMG1表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)能力下降，那么SEMG1的高表達(dá)是否會(huì)影響精子與卵子的結(jié)合成為弱精癥男性不育的致病因素？本次研究分別檢測了不同受精結(jié)局者精子SEMG1基因和蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，在體外受精受精結(jié)局<50%的精子中，SEMG1基因和蛋白的表達(dá)均高于體外受精結(jié)局≥50%的精子，說明高表達(dá)SEMG1基因的精子不僅是造成男性精子活力降低導(dǎo)致弱精癥的因素，同時(shí)也會(huì)降低體外受精成功率，這為解釋弱精癥男性高發(fā)不育癥提供了一定的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)依據(jù)。

綜上所述，弱精癥男性精子SEMG1基因表達(dá)異常升高影響精子液化導(dǎo)致精子活力降低，進(jìn)而抑制精子與卵子的結(jié)合最終造成弱精癥男性不育癥。這為解釋弱精癥的發(fā)病和治療提供了靶點(diǎn)，同時(shí)也為潛在避孕節(jié)育開發(fā)靶點(diǎn)提供思路。