梁 賢 遲學(xué)靜 葉喬生

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(濟(jì)南，250011)；2.解放軍第960醫(yī)院

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中有1/2為原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)[1]。免疫學(xué)研究認(rèn)為母-胎免疫耐受異常與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)聯(lián)系密切，T細(xì)胞活化在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，而T細(xì)胞活化需要通過共刺激分子來刺激，抑制信號(hào)來產(chǎn)生免疫活化或免疫抑制作用[2]。T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白-3(Tim-3)和程序性死亡因子-1(PD-1)是近年來被發(fā)現(xiàn)的兩種傳遞負(fù)性信號(hào)的共刺激分子。研究認(rèn)為[3]Tim-3、PD-1除了參與自身免疫性疾病、慢性感染性疾病、腫瘤免疫逃逸、移植排斥反應(yīng)等，還與母胎免疫耐受的維持與誘導(dǎo)相關(guān)。目前，臨床關(guān)于Tim-3、PD-1與病理妊娠相關(guān)性研究主要集中在適應(yīng)性免疫方面，而二者在先天免疫中的作用尚未完全明確。本研究探討URSA及先兆流產(chǎn)患者外周血單核細(xì)胞上的Tim-3、PD-1表達(dá)特征，為臨床治療、干預(yù)URSA和先兆流產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年5月-2019年5月在本院就診或規(guī)律產(chǎn)前檢查發(fā)生URSA(URSA組)、先兆流產(chǎn)早孕婦女(先兆流產(chǎn)組)和正常早孕婦女(正常組)各80例，均有停經(jīng)史，尿妊娠試驗(yàn)或血絨毛膜促性腺激素(HCG)檢測(cè)陽性，B超顯示為早期宮內(nèi)妊娠。URSA符合診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]：連續(xù)自然流產(chǎn)次數(shù)≥3次，且經(jīng)相關(guān)檢查排除雙方染色體異常、內(nèi)分泌激素異常及支原體、衣原體、弓形蟲、皰疹病毒感染等。先兆流產(chǎn)符合診斷標(biāo)準(zhǔn)：少量陰道出血，但無妊娠物排出。正常早孕婦女既往無自然流產(chǎn)、死產(chǎn)或死胎史，無內(nèi)分泌紊亂、生殖道感染、自身免疫性疾病、染色體畸形病史，孕期無腹痛或陰道出血。本研究通過了本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有孕婦均自愿參與研究并簽署了知情同意書。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1儀器與試劑美國(guó)Beckman公司生產(chǎn)的CyAN-ADP流式細(xì)胞儀、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)的氣套式三氣培養(yǎng)箱、全波長(zhǎng)掃描式多功能酶標(biāo)儀；日本TOMY公司生產(chǎn)的全自動(dòng)高壓滅菌器；美國(guó)BioLegend公司生產(chǎn)的鼠抗人CD14-FITC，PE標(biāo)記的抗小鼠Tim-3抗體、PD-1抗體試劑盒；美國(guó)R&D公司生產(chǎn)的人白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)、干擾素-γ(IFN-γ)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒。

1.2.2標(biāo)本采集與單核細(xì)胞分離采集孕婦外周靜脈血肝素抗凝，靜置后收集血漿-20℃保存。使用Ficoll密度梯度離心法分離標(biāo)本獲得單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)制備單細(xì)胞懸液(濃度1×106～2×106/ml)。

1.2.3 Tim-3、PD-1檢測(cè)取100μl單細(xì)胞懸液，分別加入CD14、PD-1、Tim-3檢測(cè)試劑，每管均設(shè)同型對(duì)照，26℃避光孵育15min，加入洗滌緩沖液洗滌，離心10min后棄上清液，再加入洗滌緩沖液使細(xì)胞重新混懸。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD14+單核細(xì)胞上的Tim-3、PD-1表達(dá)。

1.2.4 IL-4、IL-12、IFN-γ檢測(cè)冰凍血漿標(biāo)本室溫下解凍，離心，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血漿IL-4、IL-12、IFN-γ水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作，檢測(cè)OD450nm值，根據(jù)OD值、標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IL-4、IL-12、IFN-γ質(zhì)量濃度。

1.3 觀察指標(biāo)

比較各組孕婦CD14+上的Tim-3、PD-1表達(dá)水平，外周血漿IL-4、IL-12、IFN-γ表達(dá)水平；分析IL-4、IL-12、IFN-γ表達(dá)與CD14+上Tim-3、PD-1水平的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 基線資料

3組孕婦基線資料比較無差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組孕婦的基線資料比較

2.2 各檢測(cè)指標(biāo)表達(dá)

3組孕婦外周血單核細(xì)胞上的Tim-3、PD-1水平，Tim-3、PD-1水平URSA組最低，先兆流產(chǎn)組次之，正常組最高(P<0.05)。3組孕婦外周血IL-4、IL-12、IFN-γ水平比較， IL-4水平URSA組最低，先兆流產(chǎn)組次之，正常組最高； IL-12和IFN-γ水平均URSA組最高，先兆流產(chǎn)組次之，正常組最低(P<0.05)。見表2。

表2 各組血各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)比較

2.3 外周血各檢測(cè)指標(biāo)相關(guān)性分析

對(duì)URSA組、先兆流產(chǎn)組孕婦的血漿IL-12、IL-4、IFN-γ、Tim-3、PD-1水平進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果顯示，IL-12與IL-4、Tim-3、PD-1水平均呈負(fù)相關(guān)，與IFN-γ呈正相關(guān)(P均<0.05)；IL-4與IFN-γ、Tim-3、PD-1均呈正相關(guān)；IFN-γ與Tim-3、PD-1均呈負(fù)相關(guān)；Tim-3與PD-1呈正相關(guān)(均P<0.05)。見表3。

表3 外周血漿各檢測(cè)指標(biāo)相關(guān)性分析(r)

3 討論

流產(chǎn)是孕期常見并發(fā)癥，流產(chǎn)早期僅有陰道少量出血，多數(shù)經(jīng)治療或休息后可持續(xù)妊娠，為先兆流產(chǎn)[5]。隨著陰道出血量的增加，先兆流產(chǎn)也可發(fā)展為難免流產(chǎn)。自然流產(chǎn)的病因較多，宮腔粘連、子宮發(fā)育異常、子宮占位、染色體異常、內(nèi)分泌異常、感染、免疫功能紊亂等均是流產(chǎn)的常見病因。有研究指出[6]，流產(chǎn)次數(shù)越多，流產(chǎn)復(fù)發(fā)率越高，臨床將連續(xù)發(fā)生≥3次病因不明的自然流產(chǎn)定義為URSA。目前，臨床對(duì)URSA和先兆流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，有學(xué)者指出先兆流產(chǎn)和URSA的發(fā)生可能與免疫功能失衡有關(guān)[7]。母體對(duì)胎兒同種異體移植物的免疫耐受是維持妊娠的基礎(chǔ)，如果孕期母體對(duì)胎兒的免疫耐受程度降低，則會(huì)使得流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)大大增加。負(fù)性調(diào)控因子在母-胎免疫平衡中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，Tim-3、PD-1均為T細(xì)胞負(fù)性調(diào)節(jié)分子，其可由適應(yīng)性免疫細(xì)胞和先天免疫細(xì)胞共同表達(dá)，對(duì)T細(xì)胞反應(yīng)發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用，多項(xiàng)研究均已證實(shí)Tim-3和PD-1在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[8]。國(guó)外有文獻(xiàn)資料顯示[9]，人體早期免疫反應(yīng)中有Tim-3的參與，能對(duì)巨噬細(xì)胞活性發(fā)揮抑制作用。國(guó)內(nèi)有研究指出[10]，相比正常人，丙型肝炎病毒感染者外周血中單核細(xì)胞上的Tim-3表達(dá)水平明顯更高，單核細(xì)胞功能受到了明顯抑制。另有研究發(fā)現(xiàn)[11]，體外阻斷Tim-3基因表達(dá)后，單核細(xì)胞上的PD-1表達(dá)也相應(yīng)地降低，而阻斷PD-1基因表達(dá)后，單核細(xì)胞上的Tim-3表達(dá)也隨之降低，提示PD-1與Tim-3可能具有協(xié)同作用。何澤現(xiàn)等[12]研究顯示，相比未孕婦女，孕婦外周血單核細(xì)胞上的Tim-3表達(dá)和血漿中的IL-4表達(dá)明顯更高，提示單核細(xì)胞上的Tim-3可能調(diào)節(jié)IL-4等Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

本次研究顯示，相比正常孕婦，URSA和先兆流產(chǎn)孕婦CD14+T細(xì)胞上的Tim-3、PD-1水平均更低，提示流產(chǎn)的發(fā)生可能與單核細(xì)胞上Tim-3、PD-1低表達(dá)有關(guān)。這是因?yàn)門im-3、PD-1低表達(dá)會(huì)弱化其對(duì)Th1細(xì)胞的負(fù)調(diào)節(jié)作用，從而打破輔助性T細(xì)胞(Th)的平衡狀態(tài)，引起Th1/Th2平衡紊亂，不利于胎兒生存，增加流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)；另一方面，Tim-3、PD-1的低表達(dá)也會(huì)減弱其對(duì)Th17細(xì)胞分化和對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)促分化的抑制作用，從而引起Th17/Treg失衡，增加胚胎丟失風(fēng)險(xiǎn)。IL-12是由單核細(xì)胞分泌的促炎因子，能通過結(jié)合T細(xì)胞表面的IL-12受體發(fā)揮免疫活化作用，可誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生，促進(jìn)Th1細(xì)胞因子分泌，是適應(yīng)性免疫與先天性免疫的連接樞紐。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究顯示[13]，URSA患者外周血中人腦膠質(zhì)瘤組織中高遷移率族蛋白B1(HMGB1)表達(dá)升高，機(jī)體處于強(qiáng)炎癥反應(yīng)狀態(tài)。另有研究發(fā)現(xiàn)[14]，先兆流產(chǎn)患者外周血中的Th17/Treg平衡有向Th17漂移的趨勢(shì)，促炎細(xì)胞占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。本次研究結(jié)果顯示，孕婦外周血IL-12、IFN-γ水平在URSA、先兆流產(chǎn)、正常孕婦依次降低，表明相比正常孕婦，先兆流產(chǎn)和URSA孕婦體內(nèi)的促炎因子較多，抑炎因子減少，體內(nèi)炎癥反應(yīng)明顯。林春明等[15]研究顯示，URSA患者外周血中IFN-γ表達(dá)水平升高，而IL-4水平降低，Th1/Th2平衡向Th1漂移。本研究也顯示URSA和先兆流產(chǎn)孕婦的外周血IL-4水平低于正常孕婦；相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，URSA和先兆流產(chǎn)孕婦外周血IL-12、IFN-γ與Tim-3、PD-1水平均呈負(fù)相關(guān)，提示Tim-3、PD-1可能通過調(diào)節(jié)單核細(xì)胞的IL-12、IFN-γ分泌能力來發(fā)揮體液免疫和細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能，促使CD4+T細(xì)胞向Th2偏移，以保證成功妊娠。

綜上所述，URSA及先兆流產(chǎn)的發(fā)生可能與外周血單核細(xì)胞上Tim-3、PD-1表達(dá)降低有關(guān)，臨床可將其作為治療URSA和先兆流產(chǎn)的潛在靶點(diǎn)，有望從免疫反應(yīng)啟動(dòng)階段采取干預(yù)措施，以實(shí)現(xiàn)URSA的有效防治。