陳 洋 陳 莉 龍 偉 許 科

南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市婦幼保健院(213000)

絨毛膜下血腫(SCH)是指妊娠早期母胎界面的絨毛膜板與底蛻膜分離出血，隨著積聚的血液增多，血腫也逐漸形成[1]。自然妊娠早期合并絨毛膜下血腫時(shí)易出現(xiàn)母體及胎兒異常[2]，而經(jīng)體外受精胚胎移植(IVF-ET)術(shù)助孕后SCH的發(fā)生率顯著高于自然妊娠[3]。原因尚不完全明確，目前認(rèn)為可能與妊娠早期自然殺傷細(xì)胞數(shù)量的改變有關(guān)。妊娠早期子宮蛻膜組織發(fā)生自然殺傷細(xì)胞即子宮自然殺傷(uNK)細(xì)胞顯著增加?，F(xiàn)普遍認(rèn)為，uNK 細(xì)胞是由外周血中的自然殺傷細(xì)胞(pNK)中的CD56+16-NK亞群募集而來，因此若IVF-ET伴有SCH的患者外周血中該細(xì)胞亞群數(shù)量明顯變化，則可以推測兩者間可能關(guān)系。本研究首先通過測定伴有SCH的IVF-ET患者與不伴有SCH的IVF-ET患者的外周血，評估兩者之間細(xì)胞亞群的差異。另有文獻(xiàn)[4]指出， CD56+16-NK細(xì)胞可能在uNK的募集過程中扮演著重要角色。同時(shí)，黏附分子家族的整合素α4(CD49d) 及整合素αm(CD11b)亦被證實(shí)參與了uNK的募集，并發(fā)揮著重要作用[5]。因此二者的表達(dá)量是否與細(xì)胞亞群的表達(dá)存在直接的相關(guān)性，進(jìn)而在一定程度上成為預(yù)測CD56+16-NK亞群數(shù)量的特異性指標(biāo)，亦是本文探討的重點(diǎn)。本文討論IVF-ET術(shù)后臨床妊娠孕早期超聲提示合并絨毛膜下血腫的患者與未合并絨毛膜下血腫的患者外周血淋巴細(xì)胞中CD56+16+NK細(xì)胞和CD56+16-NK的細(xì)胞的數(shù)量，以及兩種亞型的NK細(xì)胞表面的整合素分子CD49d和CD11b的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019年2月-2019年12月于本院生殖中心行IVF-ET術(shù)助孕后臨床妊娠者41例為研究對象，年齡(21～35)歲，孕齡(6～11)周，其中伴有絨毛膜下血腫20例為觀察組，未合并絨毛膜下血腫21例為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：IVF-ET術(shù)后妊娠早期經(jīng)超聲檢查均可見宮內(nèi)妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：①復(fù)發(fā)性流產(chǎn)；②宮頸機(jī)能不全；③子宮肌瘤、子宮發(fā)育異常；④合并嚴(yán)重心、肝、脾、肺、腎等重要臟器病變；⑤嚴(yán)重內(nèi)分泌疾病。本研究通過本院倫理委員會(huì)審查，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

采集患者空腹靜脈血采用流式細(xì)胞術(shù)檢測。選取采血時(shí)間<2 h的無菌抗凝外周靜脈血50 ul，按照以下分組：①空白對照；②CD16-FITC+CD56-PE-Cy5；③CD16- FITC+CD56-PE-Cy5+CD49d-PE；④CD16-FITC+CD56-PE-Cy5+CD11b-PE，抗體均購自BD公司。按分組分別加入抗體5μl，避光，室溫孵育30min。加入1 ml紅細(xì)胞裂解液(BD公司)，避光37℃10min后300g離心10min，棄上清加入1ml PBS，混勻后離心10min，棄上清，每管加入200 μl PBS，混勻，15min內(nèi)采用BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀完成檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組一般情況比較

觀察組與對照組年齡(30.3±3.3歲、29.2±2.8歲)及孕周(7.6±1.1周、7.3±0.9周)無差異(P>0.05)。

2.2 外周血淋巴細(xì)胞中 CD56+CD16+NK細(xì)胞、CD56+16-NK細(xì)胞占比

外周血中CD56+CD16+NK細(xì)胞、CD56+16-NK細(xì)胞占比觀察組與對照組無差異(P>0.05)。但兩組CD56+16-NK細(xì)胞占比均低于CD56+CD16+NK細(xì)胞。見表1。

表1 兩組外周血淋巴兩種NK細(xì)胞亞群細(xì)胞中占比比較(%)

2.3 CD56+CD16+NK細(xì)胞、CD56+16-NK細(xì)胞表面CD11b表達(dá)

CD11b在觀察組CD56+CD16+NK細(xì)胞、CD56+16-NK細(xì)胞表面占比均低于對照組(P<0.05)，見圖1、圖2(1722頁)和表2。

表2 兩組NK細(xì)胞亞型表面CD11b表達(dá)占比比較(%)

2.4 CD56+CD16+NK、CD56+16-NK細(xì)胞表面CD49d表達(dá)

CD49d在觀察組CD56+CD16+NK細(xì)胞、CD56+16-NK細(xì)胞表面占比與對照組無差異(P>0.05)，見圖3、圖4(1722頁)和表3。

表3 兩組NK細(xì)胞亞型表面CD49d表達(dá)占比比較(%)

3 討論

SCH是妊娠早期患者行超聲檢查中常見的一種臨床現(xiàn)象，在IVF助孕妊娠患者中發(fā)病率較高，但目前對此類臨床現(xiàn)象發(fā)生原因探討較少。妊娠由多種淋巴免疫細(xì)胞及多種細(xì)胞因子共同參與完成。早孕期，雌孕激素水平較高，刺激外周血中的pNK迅速轉(zhuǎn)移于母胎界面，轉(zhuǎn)化為蛻膜化uNK細(xì)胞，后者隨著孕周的增加而減少[6]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，uNK 細(xì)胞對妊娠的作用主要為促進(jìn)母胎界面的血流增加、調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲作用和促進(jìn)母胎界面的免疫耐受。有學(xué)者報(bào)道SCH通過影響滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲子宮內(nèi)膜過程導(dǎo)致妊娠期并發(fā)癥的發(fā)生[7-8]。Tuckerman 等[9]強(qiáng)調(diào)，著床內(nèi)膜的局部NK細(xì)胞數(shù)量和活性可能受到植入的胚胎調(diào)控。本文探究IVF妊娠患者出現(xiàn)SCH與NK細(xì)胞水平及表面整合素分子的相關(guān)關(guān)系。

鑒于妊娠期子宮蛻膜組織無法獲得，而子宮蛻膜局部NK細(xì)胞可以通過外周血NK細(xì)胞水平反映[10]。故本研究僅檢測了患者外周血NK細(xì)胞水平。妊娠早期，子宮NK細(xì)胞源性的大顆粒淋巴細(xì)胞，即uNK細(xì)胞，主要表型為CD56+CD16-，占淋巴細(xì)胞總量的70%～80%。而外周血pNK細(xì)胞主要為CD56+CD16+表型[11]。雖然本研究中的樣本為外周血，但仍將CD56+CD16+NK細(xì)胞和CD56+CD16-NK細(xì)胞同時(shí)作為檢測指標(biāo)便于驗(yàn)證。目前研究普遍認(rèn)為，uNK是由pNK細(xì)胞中的CD56+ CD16-亞群在一系列趨化因子和黏附分子作用下從外周血中募集至妊娠子宮分化而來[12]。

整合素由α、β兩個(gè)亞基組成參與了炎癥反應(yīng)中NK細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合以及NK細(xì)胞外滲募集的調(diào)控[13]。研究顯示，β2亞基與整合素αm(CD11b)結(jié)合，促進(jìn)NK細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合及跨內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合及跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)運(yùn)，參與細(xì)胞-細(xì)胞間的黏附反應(yīng)。Santoni等[14]研究提示外周血NK細(xì)胞募集至子宮的過程亦可能受到其調(diào)控。整合素α4(CD49d)，表達(dá)于pNK細(xì)胞表面，可參與NK細(xì)胞與血管內(nèi)皮黏附的調(diào)控，通過抗體阻斷影響大鼠uNK細(xì)胞的數(shù)量和大小變化[15]。鑒于整合素在調(diào)節(jié)NK細(xì)胞粘附和穿透血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移中的重要調(diào)控作用，推測CD49d和CDllb在妊娠早期CD56+CD16-NK細(xì)胞由外周血向子宮的募集中扮演者重要的調(diào)控角色，同時(shí)妊娠子宮局部微環(huán)境可能影響了外周血CD56+CD16-NK細(xì)胞募集到子宮后的表型變化。所以本研究把兩種亞型表面整合素分子CD49d及CD11b作為檢測指標(biāo)。

本研究分析了IVF-ET術(shù)后患者妊娠早期合并絨毛膜下血腫與未合并絨毛膜下血腫者外周血中CD56+CD16+NK細(xì)胞、CD56+CD16-NK細(xì)胞及其細(xì)胞表面CD49d和CD11b的表達(dá)水平。結(jié)果顯示兩組外周血中CD56+16-NK細(xì)胞、CD56+CD16+NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比無差異，可能原因是妊娠早期合并SCH孕婦子宮蛻膜NK細(xì)胞水平與正常妊娠婦女無明顯變化，僅僅是由于蛻膜NK細(xì)胞的活性或功能受損導(dǎo)致妊娠期并發(fā)癥的發(fā)生。既往文獻(xiàn)報(bào)道，妊娠期子宮蛻膜局部血管生成因子的升高可能影響母胎界面滋養(yǎng)層細(xì)胞的生物學(xué)功能，參與妊娠并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[16]。本研究中，CD11b在CD56+CD16+NK細(xì)胞和CD56+CD16-NK細(xì)胞表面表達(dá)觀察組均低于對照組，提示CD11b在參與細(xì)胞-細(xì)胞間的黏附反應(yīng)，調(diào)節(jié)pNK細(xì)胞到子宮的募集有重要作用。進(jìn)而推測CD11b在妊娠早期NK細(xì)胞缺乏表達(dá)，造成滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力下降，母胎界面血流異常，影響胚胎著床或淺著床，甚至有可能發(fā)生免疫排斥，使絨毛膜板與底蛻膜分離出血，血液在絨毛膜與底蛻膜之間不斷積聚，形成絨毛膜下血腫。CD49d參與調(diào)節(jié)NK細(xì)胞與血管內(nèi)皮的黏附，可影響uNK細(xì)胞的數(shù)量和大小。抑制性受體和活化性受體分布在uNK細(xì)胞表面，對母體界面免疫耐受維持起重要作用；參與蛻膜局部血管生成和螺旋動(dòng)脈重塑的調(diào)控，尤其是在早孕胚胎種植期的血管生成和螺旋動(dòng)脈重塑過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[17]。CD49d表達(dá)下降時(shí)，NK細(xì)胞與血管內(nèi)皮的黏附能力下降，uNK細(xì)胞作用減弱，可能與絨毛膜血腫的發(fā)生相關(guān)。但本次研究結(jié)果提示CD49d在觀察組僅略低于對照組，未見到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，考慮可能原因是入組患者均處于妊娠狀態(tài)，無法獲取蛻膜組織，所采集的外周血標(biāo)本可能不能完全反映uNK的作用。

綜上所述，CD11b的表達(dá)可能在外周血中pNK轉(zhuǎn)化為蛻膜化的uNK細(xì)胞中發(fā)揮了重要作用。當(dāng)CD11b表達(dá)下降時(shí)，細(xì)胞與細(xì)胞間黏附作用下降，uNK的募集減少，進(jìn)而影響絨毛向子宮壁植入，導(dǎo)致絨毛膜下血腫；絨毛膜下血腫可能打破母胎界面的免疫平衡，損傷絨毛組織，導(dǎo)致不良妊娠發(fā)生。本文初步研究發(fā)現(xiàn)有一定意義，但對妊娠結(jié)局的影響仍需要進(jìn)一步研究證實(shí)。