任 云，尹芳芊，朱曉敏，王天星

（1.邯鄲學(xué)院化學(xué)化工與材料學(xué)院，河北邯鄲 056005；2.河北省雜環(huán)化合物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北邯鄲 056005；3.邯鄲市有機(jī)小分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北邯鄲 056005）

黃櫨為漆樹科黃櫨屬植物，喬木或灌木［1］。黃櫨富含黃酮類化合物、單寧、多酚類物質(zhì)及有機(jī)酸類等，還含有多種微量元素，例如鉀、鈉、鋁、鎂、硅、鈣、磷［2］，其中最主要的成分是黃酮類。至今，從黃櫨中共分離出18種黃酮類化合物，全棵不同地方的總黃酮量從大到小為根、枝莖、葉子［3］。除了黃酮類化合物外，周家永等［4］在研究黃櫨化學(xué)成分時(shí)發(fā)現(xiàn)，黃櫨的葉片、枝干和根莖中含有單寧及多酚類物質(zhì)，且因黃櫨產(chǎn)地和季節(jié)不同，其各個(gè)部位的單寧量也有很大差異。Westenburg等［5］在黃櫨提取液中分離得到五沒(méi)食子酰葡萄糖。黃櫨嫩葉可以食用，葉片和枝干均可以入藥，在我國(guó)民間，有高血壓患者發(fā)現(xiàn)黃櫨可明顯降低血壓［6］。枝干部位可提取色素作為染料，朱莉娜等［7］對(duì)黃櫨色素提取及染色工藝進(jìn)行了研究，得出超聲波提取法乙醇作為溶劑效果最好。利用黃櫨染液對(duì)真絲綢進(jìn)行超聲波染色，染色織物有一定的色牢度，媒染可提高染色真絲綢的耐皂洗色牢度。隨著人們健康意識(shí)的提高，天然色素在日常生活中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。在黃櫨中提取的天然色素可應(yīng)用在食品、印染、化妝品等行業(yè)。天然色素提取通常采用溶劑提取法，近年來(lái)，超聲、微波等輔助手段可提高提取率，其中，超聲輔助通過(guò)超聲產(chǎn)生的攪拌和機(jī)械振動(dòng)作用，破壞植物細(xì)胞的細(xì)胞壁以提高提取率，此過(guò)程沒(méi)有化學(xué)反應(yīng)，但可以縮短浸提時(shí)間或降低提取溫度，能耗低、設(shè)備要求低［8-9］。

本文利用超聲輔助溶劑提取法提取黃櫨色素，并研究色素性能。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

試劑：1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，分析純，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司），三氯化鐵、氯化鈣、氯化鈉、氯化鋁、無(wú)水硫酸銅、硫酸鎂、硫酸鋅（分析純，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司），氯化鉀、抗壞血酸、鐵氰化鉀（分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司），磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（分析純，新鄉(xiāng)市化學(xué)制劑廠）。

儀器：KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），T6紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司），WK-600A高速藥物粉碎機(jī)（青州市精誠(chéng)機(jī)械有限公司），RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），F(xiàn)A2004N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），PHS-3E pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司），DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），800型離心沉淀器（濟(jì)南市醫(yī)療機(jī)械廠），SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。

1.2 超聲輔助提取黃櫨色素

將黃櫨枝干截成小段，在65℃烘至絕干后粉碎至40目。稱量黃櫨枝干粉末1 g于錐形瓶中，加入20 mL 95%的乙醇溶液，在40℃、超聲功率500 W的條件下提取30 min得到提取液。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［10］

由單因素實(shí)驗(yàn)考察各因素對(duì)黃櫨色素提取的影響，包括超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、料液比、提取溫度。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取主要影響因素料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。以黃櫨色素提取液吸光度為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6分析軟件得到二次回歸方程和誤差分析，以確定優(yōu)化工藝并進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4 測(cè)試

紫外可見(jiàn)光譜：將提取液以4 000 r/min離心10 min，取上清液適當(dāng)稀釋，在200～520 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

吸光度：將色素提取液離心10 min，取上清液稀釋至0.1 g/L，在280 nm處測(cè)定。

提取率：準(zhǔn)確稱量黃櫨枝干粉末20 g，按響應(yīng)面法優(yōu)化工藝提取。將浸提液離心后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至浸膏后，70℃干燥至恒重，稱量，計(jì)算黃櫨色素提取率：

金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響：將黃櫨色素粉配制成1 mg/mL溶液；配制0.05 mol/L的CuSO4、KCl、CaCl2、NaCl、FeCl3、AlCl3、ZnSO4、MgSO4溶液。取 1 mL色素溶液于25 mL容量瓶中，分別用8種金屬鹽溶液定容，在20℃下靜置12 h后進(jìn)行紫外可見(jiàn)光譜掃描，與原色素溶液比較最大吸收波長(zhǎng)和吸收峰的變化，分析金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響。

黃櫨色素總還原力：配制黃櫨色素和Vc溶液。取各溶液2.5 mL于25 mL錐形瓶中，加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液2.5 mL、1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，搖勻，于50℃水浴保溫20 min，快速冷卻，加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，搖勻后以4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入1 g/L三氯化鐵溶液2.5 mL，搖勻，在20℃下靜置10 min，于700 nm處測(cè)定吸光度。

黃櫨色素清除DPPH自由基：配制黃櫨色素和Vc溶液，取各溶液5 mL，加入2×10-4mol/L DPPH乙醇溶液5 mL，搖勻，在陰涼避光、20℃下靜置30 min，在517 nm處測(cè)定吸光度A1；取各溶液5 mL，加入無(wú)水乙醇5 mL，在517 nm處測(cè)定吸光度A2；取5 mL DPPH溶液，加入5 mL蒸餾水，在517 nm處測(cè)定吸光度A0。按下式計(jì)算DPPH自由基清除率：

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外可見(jiàn)光譜

由圖1可以看出，黃櫨色素在280 nm處有最大吸收峰且穩(wěn)定存在，因此確定黃櫨色素的最大吸收波長(zhǎng)為280 nm。

圖1 黃櫨色素的紫外可見(jiàn)吸收光譜

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 超聲功率

由圖2可知，超聲輔助對(duì)提取過(guò)程有明顯影響。隨著超聲功率的增大，黃櫨色素提取液的吸光度近似線性增加，在達(dá)到最大功率500 W（由于設(shè)備硬件限制，最大超聲功率為500 W）時(shí)吸光度最大。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中控制超聲功率為500 W。

圖2 超聲功率對(duì)色素提取的影響

2.2.2 提取時(shí)間

由圖3可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黃櫨色素的吸光度先增大后減小，在20 min時(shí)出現(xiàn)最大值（黃櫨色素提取率最高）。因?yàn)樵谔崛r(shí)間較短時(shí)，超聲波產(chǎn)生的機(jī)械熱效應(yīng)和空化效應(yīng)可以使黃櫨色素被快速溶出；過(guò)度延長(zhǎng)提取時(shí)間，可能會(huì)使色素重新被吸附，從而使吸光度減小。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)固定超聲提取時(shí)間為20 min。

圖3 提取時(shí)間對(duì)色素提取的影響

2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)

由圖4可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，黃櫨色素提取液的吸光度先增大后減小。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)吸光度最大，說(shuō)明此時(shí)色素提取率最高。由此可見(jiàn)，60%的乙醇溶液極性與黃櫨色素的極性相近，色素更容易被提取出來(lái)。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)色素提取的影響

2.2.4 料液比

一般情況下，隨提取溶劑比例的增大，提取率逐漸增大，至最大值后趨于平緩或略有波動(dòng)，說(shuō)明提取物已充分提取。由圖5可知，隨著提取溶劑比例增加，吸光度先增大后減小，在料液比為1∶20時(shí)吸光度最大，之后吸光度減小，可能為正常實(shí)驗(yàn)波動(dòng)，也可能是料液比為1∶20時(shí)，提取溶液體系的滲透壓最適合色素析出。

圖5 料液比對(duì)色素提取的影響

2.2.5 提取溫度

由圖6可知，隨著提取溫度的上升，色素吸光度先增大后減小，60℃時(shí)吸光度最大，溫度太高不利于色素提取，因?yàn)闇囟忍撸刂械狞S酮類化合物穩(wěn)定性降低、結(jié)構(gòu)被破壞，吸光度下降。因此，適宜的色素提取溫度為60℃。

圖6 提取溫度對(duì)色素提取的影響

綜上所述，超聲功率與色素提取率近似成線性正相關(guān)，提取時(shí)間在20 min后，色素提取率可視為進(jìn)入平臺(tái)期，因此，兩因素不作為響應(yīng)面優(yōu)化因素。遂以色素吸光度為響應(yīng)值，對(duì)料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.3.1 建立二次回歸方程及誤差分析

對(duì)表1中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合得到二次回歸方程為：吸光度=0.350+0.027A-9.875×10-3B+0.023C+1.000×10-3AB-0.011AC-0.011BC-0.012A2-0.018B2-0.055C2。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)ANOVA進(jìn)行回歸方程誤差分析，結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面誤差分析結(jié)果

由表2可知，該方程模型高度顯著（P小于0.01），失擬誤差不顯著（P大于0.05）。CV值越小模型置信度越高，相關(guān)系數(shù)R2和Radj2越接近1，模型相關(guān)性越好。該模型的CV=3.59%、R2=0.969 5、Radj2=0.930 3。二次回歸方程對(duì)實(shí)驗(yàn)的擬合程度較高，說(shuō)明色素提取液響應(yīng)值96.95%的影響來(lái)自于所考察的3因素，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢院侠砟M實(shí)際實(shí)驗(yàn)，可以預(yù)測(cè)各因素、各水平下色素提取液的吸光度。另外，3因素中A、C、C2對(duì)色素提取液吸光度的影響高度顯著；B、B2影響顯著；AB、AC、BC、A2影響不顯著，各因素影響從大到小依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比。

2.3.2 各影響因素的交互作用

觀察圖7～9的響應(yīng)面均比較平緩，對(duì)應(yīng)等高線接近圓形，結(jié)合表2中3組交互作用P均大于0.05，表明3組交互作用均不顯著。

由圖7、圖9可見(jiàn)，兩圖中三維響應(yīng)面曲線沿料液比軸方向吸光度逐漸增加并趨于平緩，對(duì)應(yīng)的三維響應(yīng)面在底面的投影等高線沿料液比軸方向亦表現(xiàn)為吸光度逐漸增大并趨于平緩，沒(méi)有起伏。說(shuō)明提取液吸光度隨提取液用量的增加逐漸增大，色素提取率增大；料液比1∶20附近為提取率最大點(diǎn)，色素已被充分提取，繼續(xù)增加提取液用量，色素提取率不會(huì)提高。進(jìn)而說(shuō)明圖5中吸光度在最大值后出現(xiàn)降低為正常實(shí)驗(yàn)波動(dòng)。

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比響應(yīng)面曲線圖

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度響應(yīng)面曲線圖

圖9 料液比和提取溫度響應(yīng)面曲線圖

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得出優(yōu)化提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)68.03%、料液比1.00∶18.83、提取溫度61.48℃。在此工藝條件下，20 g黃櫨枝干粉末可提取色素粉1.48 g，提取率為7.4%。

2.4 色素性能

2.4.1 穩(wěn)定性

由表3可知，Na+、K+、Ca2+、Mg2+對(duì)黃櫨色素性能的影響極小，相對(duì)于原色素溶液的吸光度和最大吸收波長(zhǎng)均無(wú)明顯變化，故此4種金屬離子對(duì)黃櫨色素的穩(wěn)定性無(wú)影響；Al3+使得黃櫨色素的最大吸收波長(zhǎng)紅移了6 nm，且280、286 nm處的吸光度均有增加；Zn2+并未改變黃櫨色素的最大吸收波長(zhǎng)，但出現(xiàn)了黃色絮狀沉淀，對(duì)黃櫨色素穩(wěn)定性有不利影響；Fe3+和Cu2+分別產(chǎn)生黑綠色沉淀和深綠色沉淀，故Fe3+和Cu2+對(duì)黃櫨色素的穩(wěn)定性有極不利的影響。綜上所述，黃櫨色素溶液可以接觸 Na+、K+、Ca2+、Mg2+，根據(jù)實(shí)際情況可適當(dāng)接觸 Al3+，應(yīng)避免接觸 Zn2+、Fe3+和 Cu2+。

表3 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

2.4.2 總還原力

黃櫨色素和Vc通過(guò)自身的還原作用能使鐵氰化鉀的三價(jià)鐵還原成二價(jià)鐵，亞鐵氰化鉀與FeCl3反應(yīng)，生成在700 nm處有最大吸光度的普魯士藍(lán)，且吸光度越高，待測(cè)物的還原力越強(qiáng)。由圖10可知，黃櫨色素總還原力在所測(cè)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)大于Vc，具有較強(qiáng)的還原力。

圖10 總還原力實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.3 DPPH自由基清除能力

黃櫨色素自由基清除能力見(jiàn)圖11。

圖11 黃櫨色素自由基清除能力

由圖11可知，黃櫨色素DPPH自由基清除率隨色素質(zhì)量濃度的升高而增大，但清除能力略低于Vc。反應(yīng)后，DPPH迅速褪色為淡黃色透明溶液，且不同質(zhì)量濃度的黃櫨色素反應(yīng)后溶液的吸光度有明顯的梯度變化。在質(zhì)量濃度達(dá)到0.18 mg/mL時(shí)，清除率可達(dá)92.3%，表明黃櫨色素的自由基清除能力良好。

3 結(jié)論

（1）超聲輔助溶劑提取工藝可較好地提取黃櫨枝干中的色素。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：超聲功率與提取率成線性關(guān)系；提取時(shí)間在20 min后可達(dá)平臺(tái)期。響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定優(yōu)化工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)68.03%、提取溫度61.48℃、料液比1.00∶18.83。優(yōu)化浸提條件下20 g黃櫨枝干粉末可提取色素粉1.48 g，提取率為7.4%。

（2）Na+、K+、Ca2+、Mg2+對(duì)色素穩(wěn)定性的影響很??；Al3+使黃櫨色素的最大吸收波長(zhǎng)紅移了6 nm，吸光度增加；Zn2+、Fe3+和 Cu2+使色素產(chǎn)生沉淀。

（3）黃櫨色素總還原力比Vc強(qiáng)，DPPH自由基清除能力比Vc弱，但在質(zhì)量濃度達(dá)到0.18 mg/mL時(shí)，清除率可達(dá)92.3%。