狄 佳，周 華，李 旻，徐 婷，趙家璧

(1.蘇州大學(xué)第三附屬醫(yī)院 a.腎內(nèi)科；b.免疫風(fēng)濕科,江蘇 常州 213003;2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院 病理科，江蘇 常州 213003)

心血管疾病(CVD)是影響慢性腎臟病(CKD)患者預(yù)后最重要的因素，CKD患者心血管死亡率約占總死亡率的44%[1]，其中慢性心力衰竭為主要死因之一。心肌重構(gòu)是心力衰竭發(fā)展的一個(gè)重要病理機(jī)制，目前認(rèn)為抑制心肌重構(gòu)是預(yù)防和治療心力衰竭的重要手段，而心肌細(xì)胞肥大是心力衰竭發(fā)展過程中心肌重構(gòu)的一個(gè)主要特征之一。microRNA(miRNA)在心肌細(xì)胞肥大和凋亡中起到重要作用，其參與心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展，并可作為心力衰竭診斷、治療和預(yù)后的新的生物學(xué)標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)[2]。近年來，一種被稱為“MVs”的細(xì)胞間通訊方式越來越受到研究者們的關(guān)注[3-4]。2007年，Valadi發(fā)現(xiàn)微囊泡(MVs)中含有miRNA。生理和病理狀態(tài)下最基礎(chǔ)的細(xì)胞代謝、增殖、分化和死亡等過程均受到miRNA 的調(diào)節(jié)[5]，包含miRNA的MVs作為重要的細(xì)胞間通訊的分子平臺在疾病中的作用正成為新的研究前沿。心肌肥大時(shí)心臟miRNA-21(miR-21)表達(dá)明顯增多，有趣的是這些miR-21大多數(shù)包含于MVs，存在于心臟周圍液體中[6]，這些MVs的來源尚不清楚。本文觀察了腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生的包含miR-21的微囊泡在心肌肥大中的作用，從而可能拓展對疾病機(jī)制的理解，并可能為CKD導(dǎo)致心力衰竭的治療新策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)和處理 大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞系(NRK-52E)和大鼠心肌細(xì)胞(H9C2)購自美國模式菌種收集中心(ATCC)。用含10%胎牛血清(FBS，Life Technology)和100 U/ml青-鏈霉素(Life Technology)的D-MEM/F12培養(yǎng)液(Life Technology)，在37 ℃，含5% CO2的孵箱中培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞貼壁生長達(dá)到80%融合后，換成無血清的 D-MEM/F12 培養(yǎng)液孵育過夜(16 h)，再次更換無血清的 D-MEM/F12培養(yǎng)液，加入重組人轉(zhuǎn)化生長因子β1(rhTGF-β1，R&D Systems)處理，換成無血清的D-MEM/F12培養(yǎng)液再孵育細(xì)胞 48h，收集此無血清、無rhTGF-β1的D-MEM/F12培養(yǎng)液，依次在4℃的環(huán)境下離心：300 g×5 min，1 200 g×20 min，10 000 g×30 min，棄沉淀，再經(jīng)用濾器濃縮上清液，即為條件培養(yǎng)液。對照培養(yǎng)液的收集方法同上，但細(xì)胞未經(jīng)TGF-β1處理。受體心肌細(xì)胞用條件培養(yǎng)液處理并檢測。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Life Technology)將miR-21的抑制物或陰性對照(均購自Qiagen)轉(zhuǎn)染H9C2。依據(jù)試劑說明書，細(xì)胞50%融合后，換成無抗生素、含10%胎牛血清(FBS)的D-MEM/F12培養(yǎng)液將適量miR-21抑制物或陰性對照與250 μl無血清培養(yǎng)基(Life Technology)混合，室溫5 min，5 μl脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑與250 μl無血清培養(yǎng)基混合，室溫20 min，在37 ℃，含5% CO2的孵箱中培養(yǎng)細(xì)胞6 h后，更換為含抗生素、含10% FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)并給予相應(yīng)的處理。

1.2MVs的提取和觀察 采用差速離心的方法提取條件培養(yǎng)液中的MVs，方法概述如下：收集細(xì)胞培養(yǎng)液依次在4 ℃的環(huán)境下離心，300 g×5 min，1 200 g×20 min，10 000 g×30 min，棄沉淀，收集上清液在4 ℃的環(huán)境下離心110 000 g×60 min，沉淀物即為MVs。用適量的PBS重懸MVs。用TRIzol? LS試劑(Life Technology)提取MVs中的總RNA。用透射電鏡觀察MVs的形態(tài)，熒光染色觀察MVs，方法參照文獻(xiàn)[7]，概括如下：Dil-C18是一種膜的熒光染料，用Dil-C18染料預(yù)處理供體NRK-52E細(xì)胞1h，用磷酸緩沖淮(PBS)清洗細(xì)胞3次，依據(jù)前文所述方法收集條件培養(yǎng)基，并離心得到被Dil-C18染色的MVs。對照MVs的收集方法類似，將MVs重懸在D-MEM/F12培養(yǎng)液中，孵育受體心肌細(xì)胞，用熒光顯微鏡觀察受體細(xì)胞并拍照。

1.3miRNA的實(shí)時(shí)定量 PCR(qPCR) 用TRIzol(Life Technology)提取組織或細(xì)胞中的總RNA，用miScript RT II試劑盒(Qiagen)，以1 μg 的總RNA 為模板合成miRNA的cDNA文庫，反應(yīng)體系為20 μl(其中總RNA 模板2 μl)，充分混勻，37 ℃×60 min，95 ℃×5 min，立即置于冰上冷卻，-20 ℃保存。用miScript SYBR Green PCR試劑盒Qiagen)，以10 ng的miRNA的cDNA為模板擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μl(其中10×miScript miR-21 或U6 引物2 μl，miRNA 的cDNA 模板1 μl)，充分混勻，95 ℃×15 min×1 次，(94 ℃×15 s，55 ℃×30 s，70 ℃×34 s)×40 次，在70 ℃×34 s步驟收集熒光信號。每個(gè)樣本重復(fù)3次，采用ABI7300默認(rèn)的閾值讀取CT值，3次平均值得到CT樣本，ΔCT=CTmiR-21-CTU6，ΔΔCT=ΔCT 處理-ΔCT 對照，取2-ΔΔCT作miRNA 相對定量的柱狀圖。

1.4心肌細(xì)胞長徑的測量 H9C2心肌細(xì)胞消化后，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)，分別取2×105個(gè)細(xì)胞到6孔板中，待細(xì)胞培養(yǎng)24 h貼壁后更換細(xì)胞培養(yǎng)基為含2% FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細(xì)胞處于靜止期。不同條件培養(yǎng)結(jié)束后，用目鏡測微尺測量心肌細(xì)胞長徑。400倍鏡下每組隨機(jī)選取6個(gè)胞漿橫紋清晰、細(xì)胞核完整、形態(tài)規(guī)則的心肌細(xì)胞，測量細(xì)胞長徑。

1.5二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量的檢測 H9C2心肌細(xì)胞每孔分別加入100 μl蛋白裂解液冰浴下對細(xì)胞進(jìn)行充分裂解，細(xì)胞裂解后，收集裂解液于1.5 ml離心管中，12 000 g離心取上清，后按照BCA蛋白試劑盒說明進(jìn)行定量。

1.6酶聯(lián)免疫吸附檢測人心內(nèi)肽(ANP)水平 H9C2心肌細(xì)胞不同條件培養(yǎng)后，吸去H9C2心肌細(xì)胞的培養(yǎng)液，PBS清洗2遍后胰酶消化細(xì)胞，800 g離心收集細(xì)胞，200 μl PBS重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到新的1.5 ml離心管中。將離心管置于冰浴中超聲(45 W，15 s超聲3次，間隔15 s)以充分裂解。按照CUSABIO公司ANP試劑盒的檢測方法測定ANP濃度。每個(gè)試驗(yàn)條件設(shè)3復(fù)孔同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以其均值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SigmaStat 軟件(版本3.5，Jandel Scientific Software)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。組間比較采用方差分析和t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1TGF-β1 可誘導(dǎo)供體腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生MVs 以體外培養(yǎng)的NRK-52E為研究對象，收集對照培養(yǎng)液及5 ng/ml的TGF-β1處理細(xì)胞24 h后的條件培養(yǎng)液，分別超速離心，留取沉淀用透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)條件培養(yǎng)液沉淀物中有呈簇狀的雙層膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，直徑在50～200 nm，符合MVs的形態(tài)學(xué)特征，見圖1。

圖1 腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)液超速離心獲得的沉淀物的冷凍電鏡照片a.無TGF-β1 處理的供體腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)液超速離心獲得的沉淀物；b.5 ng/ml的TGF-β1處理的供體腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)液超速離心獲得的沉淀物。標(biāo)尺=100 nm

2.2Dil-C18 染料標(biāo)記的MVs可進(jìn)入受體心肌細(xì)胞 用Dil-C18染料標(biāo)記培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞并收集TGF-β1處理后的條件培養(yǎng)液，超速離心獲得Dil-C18染料標(biāo)記的MVs，加入受體心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中，并于不同時(shí)間點(diǎn)觀察，受體心肌細(xì)胞內(nèi)可見Dil-C18紅色熒光陽性的小顆粒，且數(shù)量隨著處理時(shí)間的延長而增加，提示MVs能從TGF-β1處理的腎小管上皮細(xì)胞傳遞到受體心肌細(xì)胞中，見圖2。

2.3TGF-β1 誘導(dǎo)產(chǎn)生的MVs可促使受體心肌細(xì)胞肥大 為探討MVs對心肌細(xì)胞的作用，我們分別用條件培養(yǎng)液經(jīng)超速離心后的上清液和沉淀的MVs處理培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，200 μl條件培養(yǎng)液沉淀的MVs處理心肌細(xì)胞48 h，能導(dǎo)致細(xì)胞長徑、蛋白濃度及ANP含量的增加，而上清液沒有上述效應(yīng)。因此，結(jié)果提示TGF-β1處理后的供體腎小管上皮細(xì)胞分泌的 MVs能促使受體心肌細(xì)胞發(fā)生肥大效應(yīng)，見圖3。

2.4TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞分泌的MVs中包含miR-21 為探討腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生MVs促使心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制，我們收集了對照組和5 ng/ml的TGF-β1處理后的腎小管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)液，超速離心分離條件培養(yǎng)液沉淀的MVs后，分別提取總RNA并檢測其中的miR-21含量，qPCR分析顯示，與對照組相比，TGF-β1處理的供體腎小管上皮細(xì)胞分泌的MVs中miR-21的含量顯著增高。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步確定MVs能否將外源性miR-21導(dǎo)入受體心肌細(xì)胞。同樣，與含有miR-21的供體NRK-52E細(xì)胞條件培養(yǎng)液中分離的MVs作用24 h后，受體心肌細(xì)胞中miR-21的含量較對照組顯著增加，見圖4。

2.5包含miR-21 的MVs誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大 為進(jìn)一步探討外源性miR-21在促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大中的作用，我們將miR-21抑制劑預(yù)轉(zhuǎn)染受體心肌細(xì)胞，并將收集的含有MVs的條件培養(yǎng)液繼續(xù)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞48 h。轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑的心肌細(xì)胞與轉(zhuǎn)染NC的對照組相比，條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)組細(xì)胞長徑、蛋白濃度和ANP含量均明顯增加，而預(yù)轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑的受體心肌細(xì)胞則未發(fā)生肥大效應(yīng)。這些結(jié)果表明，MVs誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大可被miR-21抑制劑所消除，見圖5。

圖2 用Dil-C18 染料標(biāo)記MVs，處理受體H9C2細(xì)胞不同時(shí)間后的熒光顯微鏡照片a-d.供體NRK-52E細(xì)胞經(jīng)Dil-C18染料標(biāo)記，超速離心獲得條件培養(yǎng)液的MVs，處理受體NRK-52E細(xì)胞0 h(a)、6 h(b)、12 h(c)、24 h(d)。紅色：Dil-C18標(biāo)記的MVs，藍(lán)色：細(xì)胞核

圖3 200 μl條件培養(yǎng)液沉淀的MVs處理心肌細(xì)胞48 h后細(xì)胞肥大效應(yīng)分別用條件培養(yǎng)液經(jīng)超速離心后的上清液和沉淀的MVs處理培養(yǎng)的心肌細(xì)胞細(xì)胞長徑(a)、蛋白濃度(b)及ANP含量(c)。*P<0.05

圖4 腎小管上皮細(xì)胞分泌的微囊泡中及受體心肌細(xì)胞中miR-21的含量a.對照培養(yǎng)液和條件培養(yǎng)液超速離心分離的MVs中miR-21的q-PCR結(jié)果；b.對照培養(yǎng)液及條件培養(yǎng)液中分離的MVs作用受體心肌細(xì)胞24h后miR-21的q-PCR結(jié)果。*P<0.05

圖5 MiR-21抑制劑預(yù)轉(zhuǎn)染受體心肌細(xì)胞后用含有MVs的條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)48 h后細(xì)胞的肥大效應(yīng)分別用轉(zhuǎn)染對照、含有MVs的條件培養(yǎng)液、轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑、含有MVs的條件培養(yǎng)液+轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑處理后的心肌細(xì)胞長徑(a)、蛋白濃度(b)和ANP含量(c)。*P<0.05

3 討 論

心力衰竭是CKD患者死亡的重要原因，并發(fā)心力衰竭的CKD患者數(shù)量呈持續(xù)增長，而CKD患者普遍存在多種并發(fā)癥，如高血壓、糖尿病和動脈粥樣硬化等，其均可獨(dú)立地增加心臟風(fēng)險(xiǎn)，因此很難完全明確CKD介導(dǎo)心力衰竭的潛在機(jī)制。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)抑制劑有逆轉(zhuǎn)左心室肥厚，改善左心室功能的作用[8]，但可能導(dǎo)致腎小球?yàn)V過率下降及血肌酐水平上升，引起高鉀血癥的危險(xiǎn)性增加，限制了其在嚴(yán)重腎功能不全中的應(yīng)用。而即使積極采取多種治療手段如調(diào)整血流動力學(xué)、減輕液體超負(fù)荷、糾正貧血、營養(yǎng)不良，糾正骨礦物質(zhì)代謝紊亂乃至透析治療，仍不能完全逆轉(zhuǎn)CKD時(shí)心力衰竭的發(fā)生發(fā)展，提示腎-心交互作用的復(fù)雜性，需要積極探索其他心、腎相互作用的調(diào)控因子。細(xì)胞通訊是心、腎之間相互影響的重要方式。研究發(fā)現(xiàn)MVs是介導(dǎo)非接觸的細(xì)胞間信息通訊的重要載體[9]。本研究通過觀察腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生的MVs在心肌肥大中的作用，為臨床提供新的策略及手段。

細(xì)胞在正常生理?xiàng)l件下可以產(chǎn)生少量MVs，在某些病理生理情況下產(chǎn)生明顯增多[10]。本實(shí)驗(yàn)中我們首先用TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷并收集這些細(xì)胞的條件培養(yǎng)液，采用低溫超速離心方法觀察到離心后獲得的沉淀物在電鏡下符合MVs的形態(tài)學(xué)特征，且較正常對照明顯增多。MVs是細(xì)胞狀態(tài)的縮影，一般情況下，細(xì)胞膜磷脂如磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高時(shí)，PS從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)[11]。本研究中我們用熒光染料Dil-C18標(biāo)記供體細(xì)胞，因Dil-C18是一種脂質(zhì)染料，可用于標(biāo)記供體細(xì)胞的細(xì)胞膜，MVs的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)中通常包含部分來源細(xì)胞的細(xì)胞膜成分，故當(dāng)細(xì)胞分泌MVs時(shí)MVs也被Dil-C18標(biāo)記，從而可用來驗(yàn)證供體細(xì)胞產(chǎn)生的MVs能否進(jìn)入受體細(xì)胞[12]。我們用供體細(xì)胞產(chǎn)生標(biāo)記有Dil-C18的MVs處理受體心肌細(xì)胞，結(jié)果顯示MVs可以從腎小管上皮細(xì)胞傳遞到心肌細(xì)胞，并且處理時(shí)間越長，進(jìn)入細(xì)胞的MVs數(shù)目越多。

為進(jìn)一步驗(yàn)證這些MVs的作用，我們用TGF-β1處理腎小管細(xì)胞，將收集的培養(yǎng)液經(jīng)超速離心得到的上清液和沉淀的MVs分別作用于心肌細(xì)胞，結(jié)果證實(shí)沉淀中的MVs能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，而不含有MVs的上清液則沒有該效應(yīng)，提示TGF-β1處理腎小管細(xì)胞產(chǎn)生的MVs才是真正誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的原因。雖然MVs是介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的重要載體，然而真正介導(dǎo)細(xì)胞間作用的是MVs中包含的各類分子。循環(huán)miRNA由于受到MVs的保護(hù)非常穩(wěn)定，避免了核糖核酸酶(RNase)的降解，作為運(yùn)輸miRNA的主要載體受到廣泛關(guān)注[13]。其中，miR-21能促使病理性心臟重塑和血管生成，成為心肌肥大作用中的研究熱點(diǎn)[14]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-21在高血壓腎損害中呈高表達(dá)，并推進(jìn)高血壓及其相關(guān)腎損害的病理進(jìn)程[15]，更提示外泌性MVs在心肌肥大中的重要作用。在參與腎纖維化的多種miRNAs中，miR-21也被證實(shí)起著十分重要的作用[16]。已證實(shí)纖維化腎臟小鼠模型中腎臟來源的miR-21明顯上調(diào)，且研究發(fā)現(xiàn)血循環(huán)中miR-21的水平與腎纖維化程度亦呈正相關(guān)[17]，提示腎臟纖維化時(shí)腎臟細(xì)胞分泌的miR-21可能通過MVs進(jìn)入血循環(huán)。因此在慢性心、腎疾病的進(jìn)展中，miR-21均發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。我們觀察到用TGF-β1處理腎小管細(xì)胞產(chǎn)生的MVs中含有大量的miR-21，且這些MVs作用于受體心肌細(xì)胞后可使心肌細(xì)胞中miR-21含量顯著增加，而轉(zhuǎn)染miR-21的抑制劑下調(diào)腎小管上皮細(xì)胞中miR-21含量后，能夠消除其導(dǎo)致的心肌肥大效應(yīng)，進(jìn)一步驗(yàn)證了腎臟來源的包含miRNA-21的MVs可作用于心肌細(xì)胞導(dǎo)致心肌肥大。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1處理后損傷的腎小管上皮細(xì)胞能夠分泌包含miR-21的MVs，并可介導(dǎo)miR-21從腎小管上皮細(xì)胞傳遞到心肌細(xì)胞并引起心肌細(xì)胞的肥大。系統(tǒng)研究包含miRNA的MVs在心、腎細(xì)胞間的通訊作用及對靶基因的調(diào)控將進(jìn)一步拓展對疾病機(jī)制的理解，并可能為CKD導(dǎo)致心力衰竭的治療新策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。