薄秀梅

摘要 核酸染色應(yīng)用在許多DNA檢測(cè)相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，然而染色劑結(jié)合DNA會(huì)造成電泳遲滯。為研究溴化乙錠（ethidium bromide，EB）和GelRed這2種核酸染色劑對(duì)DNA在瓊脂糖凝膠電泳中遷移速度的影響，分別用這2種染色劑采用前、后染色的方法對(duì)DNA進(jìn)行染色，以瓊脂糖凝膠電泳作為檢測(cè)方法，凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察，用Reptation理論分析數(shù)據(jù)。研究結(jié)果表明EB和GelRed染色均使DNA遷移發(fā)生了滯后，但EB對(duì)于目的基因片段大小的判讀未受電泳滯后的影響，而GelRed對(duì)目的基因判讀略有影響。然而，與EB相比，GelRed具有熒光效果強(qiáng)、安全、環(huán)保等諸多優(yōu)點(diǎn)?？傊?，需要精確鑒定目的基因片段大小可以選擇后染色或EB前染色，對(duì)于鑒定目的基因片段大小要求不高且需要熒光效果好、環(huán)保的染色劑可以選擇GelRed。

關(guān)鍵詞 EB;GelRed;遷移速度;瓊脂糖凝膠電泳

中圖分類號(hào) Q5-33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2020）03-0001-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.03.001

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract Nucleic acid dye has been used in many DNA detectionrelated fields，but the combination of different dyes with DNA can lead to electric swimming lag. To analyze the effect on mobility of DNA fragments in agarose with ethidium bromide（EB） and GelRed， we used preand poststaining with the two dyes， and the agarose gel electrophoresis was used as the detection method.Then the gel imaging system took photos and analyzed the mobility of DNA fragments with Reptation theory. The results showed that the mobility of DNA was delayed by EB and GelRed， but the EB had no effect on the measurement of DNA fragments while GelRed can influence the size of DNA fragments. But it is much more sensitive， nontoxic and environmentally safe than EB. In conclusion， prestaining with EB and poststaining can measure the DNA fragments accurately. And we can use GelRed to replace EB when the concentration of the samples is low and an environmentsafe dye is needed.

Key words EB;GelRed;Migration velocity;Agarose gel electrophoresis

核酸染色應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，如DNA指紋技術(shù)、基因工程中鑒定DNA片段的大小、重組子鑒定等。使用瓊脂糖凝膠電泳以及核酸染色劑可以簡(jiǎn)單快速地根據(jù)遷移距離結(jié)合分子量標(biāo)準(zhǔn)大致判斷DNA片段的大小。DNA在電場(chǎng)中移動(dòng)速度受到諸多因素影響，比如自身分子量、構(gòu)象、電場(chǎng)電壓、凝膠濃度、是否結(jié)合染色劑等[1]，其中染色劑結(jié)合DNA會(huì)造成電泳遲滯，這一現(xiàn)象對(duì)于判斷目的基因大小會(huì)有影響。溴化乙錠（EB）是最常用的核酸染色劑，EB具有致突變性，對(duì)環(huán)境會(huì)造成一定的污染[2]。近年來市場(chǎng)上出現(xiàn)了一些新型核酸染色劑替代EB，如SYBR safe、SYBR gold、SYBR Green Ⅰ、GelRed、GelGreen等，因GelRed與GelGreen具有安全、染色穩(wěn)定、性價(jià)比高的特點(diǎn)，目前使用越來越多，而不同核酸染色劑使DNA產(chǎn)生電泳遲滯也不盡相同。染色方式根據(jù)電泳與染色的前后關(guān)系分為前染色與后染色，前染色是將染色劑預(yù)混在瓊脂糖凝膠中，DNA在移動(dòng)過程中結(jié)合染色劑形成染色劑-DNA復(fù)合體，電泳過程中可以隨時(shí)觀察DNA移動(dòng)情況;后染色是電泳結(jié)束后再單獨(dú)染色，染色劑用量較大。前者觀察方便且染色劑用量少，應(yīng)用廣泛。

EB結(jié)合DNA形成EB-DNA復(fù)合物，增加了DNA分子量，同時(shí)改變了DNA的構(gòu)象及所帶電荷電量[3]，使得DNA在電場(chǎng)中遷移速度發(fā)生改變。隨著研究的深入，一些模型的建立可以很好地描述DNA在以瓊脂糖凝膠為介質(zhì)的電場(chǎng)中的移動(dòng)情況，Ogston模型認(rèn)為較小分子量的DNA片段可以通過凝膠孔徑，它們的遷移速度與凝膠孔徑形成的數(shù)量以及DNA分子量有關(guān)系[4]。Reptation理論認(rèn)為DNA分子會(huì)反復(fù)通過排列密集的凝膠孔徑，這些凝膠孔徑連接起來就像形成了一根管子，因此可以看成DNA在一根管子中移動(dòng)[5-7]，這一模型成功地描述了小于40 kb的DNA分子在瓊脂糖凝膠中的移動(dòng)情況，其遷移率（u）和堿基對(duì)（N）的倒數(shù)成正比[8-9]。

GelRed是一種新型核酸染色劑，使用方法簡(jiǎn)便、染色優(yōu)越、穩(wěn)定性好。當(dāng)它與DNA結(jié)合后形成GelRed-DNA復(fù)合物，對(duì)于DNA的改變與EB相似，包括DNA分子量增加、DNA構(gòu)象改變等。筆者主要研究EB與GelRed結(jié)合DNA后在瓊脂糖凝膠中的相對(duì)遷移速度變化特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株。原核載體pXMCB-B2及菌種JM101為國(guó)家級(jí)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心保存。

1.1.2 主要試劑。PCR體系、分析級(jí)瓊脂糖凝膠、質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司;凝膠純化試劑盒購自生工（上海）生物工程有限公司;1 kb DNA Ladder、Gel Loading Dye（6×）購自NEB公司;GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10 000×in Water購自Biotium公司;EB購自Sigma公司;1×TBE緩沖液（45 mmol/L Tris-Boric Acid，2 mmol/L EDTA，pH 8.3）為實(shí)驗(yàn)室配制。

1.2 方法

1.2.1 前染色1%凝膠配制。

稱取1.2 g瓊脂糖溶于120 mL 1×TBE緩沖液中，65 ℃水浴加熱待瓊脂糖全部溶解，量筒分別量取30 mL凝膠3份，分別加入GelRed 0（對(duì)照）、3 （10 000×）、6 μL（5 000×）混勻后灌至6 cm×6 cm膠槽中，然后放置于室溫約1 h待其凝固;0.5 μg/mL EB凝膠的配制同GelRed。

1.2.2 后染色。

電泳結(jié)束后將凝膠放入1 mol/L NaCl中，含GelRed 3 300×，搖床低速染色30 min。

1.2.3 電泳。

將凝膠放入同一電泳槽，使用電壓1.5 V/cm2，時(shí)間約60 min。

1.2.4 目的基因的擴(kuò)增純化。

以實(shí)驗(yàn)室保存質(zhì)粒為模板，上游引物5′-GAGAGTCCATGGCCTCAG-3′，下游引物5′-GCAAGTCAAGCTTTATTCACTCTG-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為711 bp的目的基因，測(cè)序正確后凝膠純化、測(cè)定濃度后備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 EB與GelRed染色特點(diǎn)

圖1為2塊凝膠，左圖和右圖分別使用EB（0.5 μg/mL）和GelRed（10 000×）作為染色劑，染色方式均為前染色，樣品為1 kb DNA Ladder（NEB）。上樣量分別為500、250、125 ng，電泳條件相同，電泳結(jié)束后將2塊凝膠放入成像系統(tǒng)中，上樣孔處于同一水平線，拍照觀察，有如下幾點(diǎn)現(xiàn)象：①EB染色較GelRed染色DNA遷移速度快;②DNA濃度對(duì)于遷移速度影響不明顯;③隨著濃度的降低熒光強(qiáng)度均出現(xiàn)不同程度的衰減;④對(duì)于大于3 000 bp的DNA片段，EB的分辨效果好于GelRed。

2.2 EB與GelRed均使DNA產(chǎn)生遷移滯后

上述結(jié)果表明，250 ngDNA的上樣量比較合適，且EB染色較GelRed染色遷移速度快。配制3塊1%瓊脂糖凝膠，其中1塊無染色劑，另外2塊分別加入染色劑EB（0.5 μg/mL）、GelRed（10 000×），樣品為1 kb DNA Ladder（NEB），上樣250 ng電泳條件相同。電泳結(jié)束后將無染色劑凝膠放入容器進(jìn)行后染色，染色劑為GelRed（3 300×），時(shí)間30 min，染色結(jié)束后將3塊凝膠放入成像系統(tǒng)，上樣孔處于同一水平線拍照觀察（圖2）。結(jié)果表明，后染色DNA遷移速度最快，其次為EB前染色，GelRed前染色最慢，以上說明EB、GelRed結(jié)合DNA均使得DNA遷移滯后，但GelRed影響更大。

2.3 EB與GelRed染色劑使DNA遷移滯后對(duì)目的基因判讀的影響

用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步檢測(cè)染色劑結(jié)合DNA引起的遷移滯后對(duì)目的基因判讀的影響分別制備3塊凝膠，其中1塊凝膠不含染色劑，另外2塊膠分別加入EB和GelRed，終濃度為0.5 μg/mL、10 000×，使用1 kb DNA Ladder（NEB）作為分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)已知的目的基因進(jìn)行判讀，該目的基因片段大小為3 973 bp，在相同條件下進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后將無染色劑凝膠放入容器進(jìn)行后染色，染色劑為GelRed（3 300×），時(shí)間30 min，染色結(jié)束后將3塊凝膠放入成像系統(tǒng)（圖3），發(fā)現(xiàn)后染色與EB前染色對(duì)于目的基因的判讀基本一致，均為4 000 bp，而GelRed前染色目的基因移動(dòng)速度比4 000 bp的分子量標(biāo)準(zhǔn)稍慢，由此可見后染色及EB染色對(duì)于目的基因的判讀相對(duì)于GelRed準(zhǔn)確。筆者認(rèn)為，GelRed結(jié)合DNA使其遷移速度改變，這種變化對(duì)于目的基因的檢測(cè)造成了一定程度的影響，而EB未發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象。

2.4 用Reptation理論解釋EB和GelRed結(jié)合DNA對(duì)目的基因判讀的影響

Reptation理論認(rèn)為在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)的DNA片段其遷移率（u）和堿基對(duì)（N）的倒數(shù)成正比[8-9]?？梢杂肦eptation理論來檢測(cè)不同染色劑結(jié)合DNA后其遷移速度的變化特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)分為2組對(duì)比分析DNA結(jié)合染色劑后的遷移速度，第一組為后染色組（對(duì)照組）、0.5 μg/mL EB前染色組;第二組為對(duì)照組、10 000×GelRed前染色組、5 000×GelRed前染色組。凝膠制備及電泳條件均一致，用1 kb DNA Ladder（NEB）進(jìn)行上樣，上樣量為250 ng，電泳結(jié)束后將對(duì)照組凝膠放入容器進(jìn)行后染色，待染色結(jié)束后在放置標(biāo)尺的凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行拍照，選取2 000、3 000、5 000、8 000、10 000 bp的DNA片段測(cè)量其遷移距離并記錄，以1/N為橫坐標(biāo)，遷移距離為縱坐標(biāo)，將數(shù)據(jù)錄入Excel軟件建立直角坐標(biāo)系，如圖4所示，DNA的遷移距離與其堿基對(duì)數(shù)量的倒數(shù)成正比，每組數(shù)據(jù)的r2均大于0988。發(fā)現(xiàn)0.5 μg/mL EB染色與對(duì)照組的標(biāo)準(zhǔn)曲線幾乎平行，說明其線性關(guān)系的系數(shù)與對(duì)照組很接近，DNA在凝膠中遷移雖然發(fā)生了滯后，但遷移特性最接近對(duì)照組。10 000×GelRed、5 000×GelRed前染色組的標(biāo)準(zhǔn)曲線與對(duì)照組傾斜角度并不一致，說明其線性關(guān)系的系數(shù)與對(duì)照組有差別，其遷移特性與對(duì)照組也有所不同，但是GelRed濃度對(duì)其遷移特性的影響不大。綜上所述，認(rèn)為EB、GelRed結(jié)合DNA后使DNA遷移產(chǎn)生滯后，但是EB染色產(chǎn)生的遷移滯后對(duì)于目的基因的判讀未產(chǎn)生明顯影響，而GelRed略有影響。

3 討論

隨著分子生物學(xué)及化學(xué)合成技術(shù)的發(fā)展，一些新型的核酸染色劑給人們的技術(shù)手段帶來了很大的突破，Molecular Probes公司開發(fā)了SYBR系列的產(chǎn)品，該系列目前有4款產(chǎn)品，SYBR Green I 結(jié)合雙鏈DNA能力很強(qiáng)，檢測(cè)微量雙鏈DNA的能力優(yōu)于其他核酸染色劑[10]，能特異性地結(jié)合雙鏈DNA而對(duì)單鏈DNA的結(jié)合能力大大減弱，這一特點(diǎn)可使SYBR Green I作為實(shí)時(shí)定量PCR染色劑，另外有文獻(xiàn)報(bào)道SYBR Green I有堿基親和特異性[11]，而這種親和特異性表現(xiàn)在瓊脂糖凝膠電泳中會(huì)造成AT堿基含量較高DNA片段的電泳偏差[12]。SYBR Green Ⅱ作為一款新型核酸染色劑可以特異性結(jié)合RNA和單鏈DNA，可以彌補(bǔ)SYBR Green I結(jié)合RNA及單鏈DNA的能力弱的特性，SYBR safe與SYBR gold可以結(jié)合雙鏈DNA、單鏈DNA以及RNA，具有檢測(cè)能力高、安全、穩(wěn)定的特點(diǎn)，SYBR Green Ⅱ與SYBR gold在Ames試驗(yàn)中顯示不具有致突變性[13]。PicoGreen作為一款核酸定量的染色劑可以對(duì)雙鏈DNA精準(zhǔn)定量，最小檢測(cè)25 pg的痕量雙鏈DNA，不易受到單鏈DNA及RNA的干擾，比傳統(tǒng)方法更精確[14]。GelRed作為一種新型的核酸染色劑可以結(jié)合雙鏈DNA、單鏈DNA及RNA，但對(duì)于雙鏈DNA的結(jié)合能力強(qiáng)于單鏈DNA及RNA，可用于瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠染色，染色后熒光效果優(yōu)于EB，對(duì)較小片段的DNA的檢測(cè)能力尤為突出，具有和EB相同的光譜范圍，另外無毒、對(duì)環(huán)境安全、廢膠及廢液可直接排放而無需特殊處理等諸多優(yōu)勢(shì)使得越來越多的科研機(jī)構(gòu)采用了這種新型的核酸染色劑。在使用方面，GelRed后染色要比前染色更加靈敏，且DNA遷移不受染色劑的影響，對(duì)目的基因的判讀準(zhǔn)確，但是用量較大;前染色具有操作簡(jiǎn)便，不需單獨(dú)染色以及節(jié)約用量等優(yōu)點(diǎn)，但DNA結(jié)合染色劑會(huì)產(chǎn)生遷移滯后。在凝膠回收方面，GelRed結(jié)合DNA后易被乙醇洗脫，因此DNA可以回收用于下游試驗(yàn)[15]。綜上，如果需要較為精確鑒定目的基因片段大小可以選擇后染色或者EB前染色，如果對(duì)鑒定目的基因片段大小要求不高，不具備生物污染處理系統(tǒng)或者鑒定含量較低的目的基因片段的科研機(jī)構(gòu)可以選擇GelRed。

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